沙棘葉總黃酮分離純化研究進(jìn)展

摘要 通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)相關(guān)文獻(xiàn)，概述沙棘葉中沙棘葉總黃酮的分離純化方法。結(jié)果顯示，沙棘葉總黃酮的分離純化方法有X5大孔吸附樹(shù)脂純化法、胺基吸附樹(shù)脂純化法、FL1多功能吸附樹(shù)脂純化法、硅膠分離純化法、硅膠G分離純化法和Wakogel40C18硅膠層析柱分離純化法。雖然已有不少沙棘葉總黃酮的分離純化方法，但隨著新藥研發(fā)中對(duì)有效部位要求的提高，還需進(jìn)一步優(yōu)化沙棘葉總黃酮的分離純化方法。

關(guān)鍵詞 沙棘葉；總黃酮；分離；純化

中圖分類(lèi)號(hào)S567；R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2014）30-10517-02

基金項(xiàng)目“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)（2008ZXJ09004009）。

作者簡(jiǎn)介萬(wàn)方瓊（1989- ），女，重慶人，從事中藥化學(xué)研究。*通訊作者，主管藥師，博士，從事中藥化學(xué)和藥理研究。

沙棘（Hippophae rhamnoides L.）屬胡頹子科沙棘屬植物[1-2]。我國(guó)是世界上沙棘資源最多的國(guó)家，沙棘有優(yōu)異的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生態(tài)效益，具有耐脊薄、耐鹽堿、耐寒、耐旱且繁殖能力強(qiáng)、固氮能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[3]。沙棘中含有上百種生物活性物質(zhì)，有多糖類(lèi)、氨基酸、蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶、5-羥色胺、黃酮類(lèi)、萜類(lèi)及甾體類(lèi)等[4-5]。沙棘有活血散瘀、化痰寬胸、補(bǔ)脾健胃等功能，可用于跌打損傷、瘀血腫痛、胃痛、呼吸不暢、食欲不振等癥[6-7]。近年來(lái)，許多新技術(shù)和方法廣泛用于沙棘葉總黃酮的提取分離純化研究，這些方法為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)以沙棘葉總黃銅為原料的產(chǎn)品奠定了基礎(chǔ)。筆者在此就沙棘葉總黃酮的分離純化方法研究進(jìn)展作一概述。

1樹(shù)脂純化沙棘葉總黃酮

1.1X5大孔吸附樹(shù)脂孫天宇用大孔吸附樹(shù)脂純化沙棘葉黃酮，采用X5大孔吸附樹(shù)脂，用65%乙醇，25 ℃的條件下靜態(tài)吸附2 h，靜態(tài)洗脫2.5 h，結(jié)果表明，動(dòng)態(tài)吸附速率為2 BV/h，上樣濃度2.5 mg/ml；動(dòng)態(tài)解吸速率2 BV/h，75%乙醇3倍樹(shù)脂體積洗脫，通過(guò)此條件純化的沙棘葉總黃酮的純度可達(dá)89.72%[8]。

1.2胺基吸附樹(shù)脂孫江曉通過(guò)研究不同極性胺基吸附樹(shù)脂表面結(jié)構(gòu)對(duì)吸附的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)物的純度隨樹(shù)脂表面極性的增大而增高，而同時(shí)具有高比表面積和強(qiáng)極性的胺基吸附樹(shù)脂對(duì)沙棘葉黃酮具有較高的選擇吸附能力[9]。ADS5型樹(shù)脂是由大孔二乙烯苯聚合而成的，具有極性最低，純化后沙棘葉總黃酮產(chǎn)率高，但純度較低，將原樹(shù)脂上的功能基化合成具有不同胺基含量和胺基結(jié)構(gòu)的新樹(shù)脂，通過(guò)研究胺基在沙棘葉黃酮提取分離中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)功能基含量適當(dāng)和較強(qiáng)堿性的胺基吸附樹(shù)脂可制備出較高純度的沙棘葉黃酮；通過(guò)研究不同功能基含量的胺基吸附樹(shù)脂對(duì)沙棘葉總黃酮的純度的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，比表面積和基團(tuán)含量較高時(shí)，方可得到具有較高純度的沙棘葉黃酮；在研究處理量對(duì)沙棘葉黃酮純度的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，處理量較低時(shí)，才能得到較高純度的產(chǎn)品，在實(shí)際生產(chǎn)中可根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)奶幚砹縖9]。選擇適當(dāng)極性的洗脫劑，控制洗脫劑的用量，可得較高純度的沙棘葉總黃酮。

1.3FL1多功能吸附樹(shù)脂 歐來(lái)良等以Kromasil C18 （150 mm×4.6 mm，5 μm）為色譜柱，以甲醇-水-磷酸緩沖液（55∶45∶0.3）為流動(dòng)相，體積流量為0.8 ml/min，以70%乙醇作洗脫劑，常溫下過(guò)柱，在254 nm下檢測(cè)波長(zhǎng)，產(chǎn)品中總黃酮含量可達(dá)40.2%；通過(guò)研究FL-1多功能吸附樹(shù)脂對(duì)沙棘葉黃酮吸附性能的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，沙棘葉質(zhì)量與樹(shù)脂體積比為1∶2，洗脫劑為70%乙醇，體積為4倍床體積時(shí)基本可以完全洗脫[10]。

1.4MAEGDMA樹(shù)脂王芃等研究表明EGDMA比例為15%的E15NC樹(shù)脂有最適宜的功能基團(tuán)和骨架結(jié)構(gòu)，對(duì)沙棘葉黃酮有較好的選擇吸附性；以沙棘葉黃酮粗提物（總黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.4%）作為原料，結(jié)合吸附劑用量和吸附速度、解吸劑用量和解吸劑體積分?jǐn)?shù)及解吸速度等對(duì)純化結(jié)果影響的考察，確定沙棘葉總黃酮在吸附劑用量為1 BV，吸附速度為1 BV/h，以80%乙醇水溶液作解吸劑，用量2 BV，解吸速度為0.5 BV/h進(jìn)行純化，總黃酮質(zhì)量的分?jǐn)?shù)可提高427%，產(chǎn)率達(dá)85.4%[11]。

2硅膠分離純化沙棘葉總黃酮

2.1硅膠G稱(chēng)取沙棘葉5 kg裝入到柱型油脂提取器中，用石油醚提取除去色素低極性物質(zhì)，回流至石油醚呈無(wú)色，用70%甲醇提取黃酮類(lèi)物質(zhì)；將甲醇提取液減壓蒸餾，回收甲醇得到濃縮液；重復(fù)用正己烷萃取，提出葉蠟、色素等多種脂溶性物質(zhì)。母液再減壓濃縮至干，得到的即為沙棘葉中的黃酮部分，用甲醇溶解濃縮液后供下一步分離使用。沙棘葉提取物中的黃酮部分，用硅膠薄層層析展開(kāi)分析（薄層色譜板為2.5 cm×7.5 cm），展開(kāi)劑為丙酮和正己烷混合溶劑（2∶5），顯色劑為茴香醛乙醇濃硫酸的混合溶液。黃酮部分浸膏，用硅膠柱層析（柱長(zhǎng)28 cm，內(nèi)徑2.5 cm），填充硅膠的規(guī)格為硅膠G，以丙酮和正己烷的混合溶劑（2∶7）為洗脫液，采用定時(shí)收集的方式收集，薄層色譜分析，合并濃縮后分離。選取硅膠柱層析分離得到的濃縮液中成點(diǎn)性較好的部分，用少量無(wú)水甲醇溶解；加入到葡聚糖凝膠柱層析，用無(wú)水甲醇洗脫，薄層色譜跟蹤、收集淡黃色的部分，經(jīng)乙醇重結(jié)晶得到淡黃色粉末化合物III（6 mg）。樣品溶于熱甲醇中，加入鎂粉再加濃硫酸，均呈橙紅色；樣品呈三氯化鋁反應(yīng)；紫外光下觀(guān)察為黃綠色熒光，故推測(cè)其為黃酮類(lèi)化合物。樣品再經(jīng)1H核磁共振波譜圖分析和13C核磁共振波譜圖分析，分析鑒定化合物III為3'，4'，3，5，7-五羥基黃酮（槲皮素）[12-13]。

2.2硅膠H當(dāng)填充硅膠的規(guī)格為硅膠H，按上述“2.1”步驟處理，經(jīng)乙醇重結(jié)晶得到淡黃色晶體4 mg，經(jīng)紅外光譜和核磁共振譜圖分析鑒定，該化合物為4，4′二羥基2′甲氧基查耳酮[14]。

2.3Wakogel40C18硅膠層析柱將沙棘葉粉碎過(guò)篩，取60目的沙棘葉粉末，加50%甲醇，按固液比為1∶30常溫提取并濃縮，往濃縮液中加入3倍體積的乙醚，振蕩萃取，取水層萃取液并濃縮，即為沙棘葉粗提物。將沙棘葉粗提物沿柱管內(nèi)壁緩慢加入含Wakogel40C18的硅膠層析柱內(nèi)，待粗提物液面接近填料表面時(shí)，用1倍填料體積的10%（v/v）甲醇溶液緩慢沖洗內(nèi)壁，待沖洗液接近填料表面時(shí)，依次用甲醇：水（10∶90）、甲醇∶水（20∶80）、甲醇∶水（30∶70）、甲醇∶水（40∶60）、甲醇∶水（50∶50）洗脫，用餾分收集器收集流出液，每800滴收集一份，共246份。收集的樣品用清除DPPH自由基法檢驗(yàn)其抗氧化性，選出清除能力強(qiáng)的收集液，用高效液相色譜儀檢測(cè)，合并相同成分。用高效制備色譜純化初篩出的餾分，根據(jù)分析時(shí)的出峰時(shí)間制定流動(dòng)相分析分離條件，用核磁共振波譜和氣相色譜-質(zhì)譜定性分離純化，分離得到木麻黃素、槲皮素3O葡萄糖苷、槲皮素3O葡萄糖70鼠李糖苷、異鼠李素3O蘆丁糖苷、異鼠李素3O葡萄糖苷、異鼠李素3O蘆丁糖苷70鼠李糖苷、異鼠李素70鼠李糖苷[15]。

3展望

總黃酮是沙棘中重要的生物活性部位，沙棘葉中的總黃酮含量是沙棘各個(gè)部位中最高的，研究沙棘葉總黃酮的分離純化具有重要的意義。目前國(guó)內(nèi)外已開(kāi)發(fā)出許多以沙棘或沙棘中有效成分為主要原料的單復(fù)方藥物制劑、保健品、食品等產(chǎn)品，未來(lái)沙棘葉總黃酮的分離純化技術(shù)將向著更環(huán)保、更高效、更精細(xì)的方向發(fā)展，使這一天然綠色資源得到更廣泛的開(kāi)發(fā)和利用。

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