六味地黃湯對慢性腎衰大鼠腎組織中HIF—1α和PAI—1表達的影響

[摘要] 目的 探討六味地黃湯抗腎間質纖維化的作用機制。 方法 5/6腎切除法制備慢性腎衰模型，分假手術組、模型組、六味地黃湯組和依那普利組。六味地黃湯組予以6.25 g/（kg·d）六味地黃湯灌胃，依那普利組予以10 mg/（kg·d）依那普利灌胃，假手術組和模型組予以10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，每天1次，連續灌胃12周。造模12周后，應用免疫組化法和RT-PCR法分別檢測HIF-1α、PAI-1在腎組織中蛋白水平和基因表達。 結果 與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達均明顯降低（P<0.05），且六味地黃湯組低于依那普利組（P<0.05）。 結論 六味地黃湯可能通過降低HIF-1α，進而下調PAI-1的表達抑制腎間質纖維化，且治療效果優于依那普利。

[關鍵詞] 腎纖維化；缺氧誘導因子1α；纖溶酶原激活物抑制劑-1；六味地黃湯

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2014）36-0009-04

Effects of six ingredient rehmannia decoction on expression of HIF-1α and PAI-1 in chronic renal failure rats

TANG Qun1 ZHANG Xi1 WU Hua2 CHEN Li1 LIU Chunyan1

1.Department of Pathology， Hu’nan University of Chinese Medicine， Changsha 410208， China； 2.Furong Judicial Identification Center， the Second people's Hospital of Hu’nan Province， Changsha 410007， China

[Abstract] Objective To investigate the mechanism of six ingredient rehmannia decoction against renal interstitial fibrosis. Methods The rat model of renal interstitial fibrosis were induced by 5/6 nephrectomy， rats were divided into sham operation group， model group， six ingredient rehmannia decoction group and enalapril group. Six ingredient rehmannia decoction group was given 6.25 g/（kg·d） of six ingredient rehmannia decoction gavage， enalapril group was given 10 mg/（kg·d） enalapril lavage， sham operation group and model group were given 10 mL/（kg·d） of distilled water， 1 times a day， continuous intragastric administration for 12 weeks. 12 weeks after modeling， immunohistochemical method and RT-PCR method were used to detect protein levels and gene expression of HIF-1α and PAI-1 in renal tissue respectively. Results Compared with the sham operation group， the renal tissue of HIF-1 α， PAI-1 protein level and gene expression were increased significantly in model group（P<0.05）； Compared with the model group， the renal tissue of HIF-1 α， PAI-1 protein levels and gene expression were decreased significantly in six ingredient rehmannia decoction group and enalapril group（P<0.05）， and the six ingredient rehmannia decoction group was better than that of enalapril group（P<0.05）. Conclusion Six ingredient rehmannia decoction can decrease the HIF-1 α， and down regulate the expression of PAI-1 inhibits renal interstitial fibrosis， and the treatment effect is better than that of enalapril.

[Key words] Renal fibrosis； Hypoxia-inducible factor 1α； Plaminogen activator inhibitor-1； Six ingredient rehmannia decoction

慢性腎臟病早期腎內普遍存在缺氧，且缺氧是導致腎間質纖維化的關鍵因素[1]。慢性腎臟病時，腎內缺氧可誘導缺氧誘導因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）表達增加，后者可上調一系列致纖維化靶基因的表達，從而促進腎纖維化進展[2]。纖溶酶原激活物抑制劑-1（plaminogen activator inhibitor-1，PAI-1）是重要的促纖維化因子，且缺氧誘導的PAI-1基因表達受HIF-1α調控[3]。因此，本研究旨在通過對HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達的檢測，觀察六味地黃湯是否能下調HIF-1α、PAI-1的表達，從而抑制5/6腎切除模型中大鼠腎間質纖維化的進展，為慢性腎臟疾病的防治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 清潔級健康雄性SD 大鼠70只，鼠齡4～5周，體質量（180±20）g，飼養于湖南中醫藥大學SPF級動物房，動物合格證號：SCXK（湘）2009-0001。

1.1.2 藥物制備 六味地黃湯（配方：熟地黃24 g，山藥12 g，山茱萸12 g，澤瀉9 g，茯苓9 g，牡丹皮9 g），由湖南中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科提供。每劑藥材75 g，每天煎一劑。藥材先用相當于藥材5倍量的自來水浸泡20 min，煮沸后再微火煮20 min，過濾得一煎液，剩余藥渣再加少量蒸餾水，煎煮得二煎液，兩煎液混合，3層紗布過濾后置水浴恒溫器，濃縮至含生藥1 g/mL。依那普利（湖南千金湘江藥業股份有限公司，10 mg×16 s，國藥準字H20066383），每片10 mg溶解于10 mL生理鹽水，藥液濃度為1 mg/mL。

1.1.3 主要試劑 一抗兔抗大鼠HIF-1α、PAI-1多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，二抗山羊抗兔IgG 抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司；免疫組化檢測試劑盒、DAB 顯色試劑盒購自武漢博士德公司，Trizol購自美國MRC公司，Taq DNA 聚合酶、dNTPs和RT 試劑盒均購自美國Fermentas公司，逆轉錄試劑盒購自美國Promega公司，引物由英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 造模 SD 雄性大鼠70只，隨機分為假手術組（10只）、模型組（20只）、六味地黃湯組（20只）和依那普利組（20只）。模型組、六味地黃湯組和依那普利組均在無菌條件下進行5/6腎切除術，0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射 10%水合氯醛麻醉大鼠，常規消毒、鋪巾、剖腹、迅速切除左腎上、下極，明膠海綿壓迫止血，復位腎臟，縫合腎臟各層組織。一周后切除對側腎臟。假手術組僅打開腹腔暴露腎臟，但不切除。

1.2.2 給藥 造模后第2天，六味地黃湯組予以六味地黃湯6.25 g/（kg·d）灌胃，依那普利組予以10 mg/（kg·d）依那普利灌胃，假手術組和模型組以10 mL/（kg·d）蒸餾水灌胃，1次/d，連續12周。大鼠在給藥過程中途死亡者直接予以剔除。

1.2.3 標本收集 灌胃12周后，麻醉大鼠，剖腹，腹主動脈取血，代謝籠收集死前24 h尿量，腎組織一部分用10%甲醛固定，用于HE染色和免疫組化檢測。另一部分保存于-80℃超低溫冰箱，用于RT-PCR檢測。

1.2.4 腎功能檢測 Elisa法檢測24 h尿白蛋白（24 h UAlb），酶法測定血肌酐（SCr）濃度，尿素酶-GLDH法測定尿素氮（BUN）濃度。

1.2.5 腎臟組織形態學檢查 10%甲醛固定腎組織，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，浸蠟，石蠟包埋，做4 μm厚連續切片，進行HE染色，顯微鏡觀察各組大鼠腎組織病理變化。

1.2.6 免疫組織化學法檢測 一抗分別用兔抗大鼠HIF-1α多克隆抗體（工作濃度為1：50）和PAI-1多克隆抗體（工作濃度為1：100），二抗用相應山羊抗兔抗體（工作濃度按產品說明書配制為1：100），光學顯微鏡下觀察每張切片，陽性呈黃色、棕黃色或棕褐色。高倍鏡下（×400）隨機選取5 個互不重疊的視野，計算機圖像分析系統測定每個視野陽性染色的平均灰度值，半定量法評估，測得平均灰度值越小，表示免疫陽性程度越強。

1.2.7 RT-PCR檢測 用Trizol法提取總RNA，首先在逆轉錄緩沖液中合成cDNA，然后PCR擴增目的基因HIF-1α、PAI-1以及內參基因β-actin片段。反應條件：94℃預變性5 min，循環采用94℃變性0.5 min，退火時間1 min，退火溫度（HIF-1α：57.5℃，PAI-1：59℃），72℃延伸1 min，30個循環后，72℃延伸10 min，4℃存放。引物序列：HIF-1α 上游5’-GTTTA CTAAAGGACAAGTCACC-3’，下游5’-TTCTGTTTGTTGAAG-GGAG-3’；PAI-1上游5’-GGCTTCATGCCCCACTTCTTC-3’，下游5’-ATTCACCAGCACCAGGCGTGT-3’；β-actin上游5’-ACCCACACTGTGCCCATCTATGA-3’，下游5’-CATCGGAACCGCTCATTGCCGATAG-3’。PCR產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，Tanon GIS 2020凝膠圖像分析系統拍照，圖像分析獲得條帶累積光密度數值，以β-actin為內參對照，計算HIF-1α/β-actin、PAI-1/β-actin比值，進行統計分析。

1.3 統計學分析

采用SPSS 19.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料以（x±s）表示，多組均數的比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LDS法，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 四組大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐比較

模型組大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐較假手術組均明顯升高（P<0.05）；而六味地黃湯組和依那普利組較模型組均明顯降低（P<0.05），且六味地黃湯組降低更明顯（P<0.05）。見表1。

表1 四組大鼠24 h尿蛋白、血清尿素氮和血肌酐比較（x±s）

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與六味地黃湯組比較，cP<0.05

2.2 四組大鼠腎組織HE染色結果比較

假手術組腎小球結構清晰，腎小管上皮細胞排列整齊；模型組大部分腎小球硬化，腎小管萎縮、消失，部分管腔內可見蛋白管型，腎間質纖維化明顯；六味地黃湯組和依那普利組腎小球硬化、腎小管萎縮及間質纖維化程度均有不同程度減輕，見圖1。

圖1 造模12周后四組大鼠腎組織HE染色結果比較（×400）

A假手術組；B模型組；C六味地黃湯組；D依那普利組

2.3 免疫組化結果比較

2.3.1 HIF-1α的表達 假手術組HIF-1α在大鼠腎組織內微量表達，模型組在大鼠腎小管上皮細胞胞漿、核內表達呈棕褐色；六味地黃湯組和依那普利組在大鼠腎小管上皮細胞胞漿、核內表達呈棕黃色或黃色，見圖2。

2.3.2 PAI-1的表達 假手術組PAI-1在大鼠腎組織內微量表達；模型組表達量明顯增加，腎小管上皮細胞胞核、刷狀緣有棕褐色陽性顆粒；六味地黃湯組和依那普利組表達減弱，陽性顆粒呈棕黃色，見圖3。

2.3.3 四組腎組織HIF-1α、PAI-1免疫陽性細胞半定量比較 見表2。模型組HIF-1α、PAI-1免疫陽性細胞半定量較假手術組明顯降低（P<0.05）；六味地黃湯組和依那普利組HIF-1α、PAI-1免疫陽性細胞半定量較模型組升高（P<0.05），且六味地黃湯組升高更明顯。免疫陽性細胞半定量越低，其蛋白表達越高，所以與假手術組比較，模型組大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達均明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，而六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎組織中HIF-1α、PAI-1蛋白水平和基因表達均明顯降低（P<0.05），且六味地黃湯組低于依那普利組（P<0.05）。

表2 四組大鼠腎組織HIF-1α、PAI-1免疫陽性細胞半定量比較（x±s）

注：與假手術組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與六味地黃湯組比較，cP<0.05

2.4四組腎組織HIF-1α、PAI-1 mRNA相對表達量比較

模型組HIF-1α、PAI-1 mRNA的表達較假手術組明顯增加（P<0.05），而六味地黃湯組和依那普利組HIF-1α、PAI-1 mRNA的表達較模型組明顯降低（P<0. 05），且六味地黃湯組降低更明顯，見表3。

3 討論

慢性腎功能衰竭（chronic renal failure，CRF）主要病理學特征為腎小球硬化和腎間質纖維化。慢性缺氧可導致腎小管間質損傷，促進腎間質纖維化[4]。缺氧主要通過HIF-1 及其氧敏感元件HIF-1α發揮作用[5]。因此，HIF-1α被認為是導致纖維化的關鍵因子[6]。已有研究表明，HIF-1α可調控促纖維化因子PAI-1的表達[7]， PAI-1是纖溶酶原激活物抑制劑（PAIs）的主要形式，PAIs是PAs的生理性特異抑制物。PA與PAI-1是細胞外基質（extracellular matrixc，ECM）降解過程中保持蛋白質溶解與抗蛋白溶解間平衡的主要參與者。在組織內PAI-1水平升高和（或）活性增強，可抑制纖溶酶原激活物對ECM降解，引起ECM聚集，導致組織纖維化。

六味地黃湯出自北宋錢乙《小兒藥證直訣》，為六味地黃丸改為湯劑，其由熟地黃、山萸肉、懷山藥、牡丹皮、澤瀉、茯苓六味藥組成，主治腎陰虛證。六味地黃丸（湯）是臨床上治療腎陰虛證型慢性腎小球腎炎的有效方劑[8]。前期研究發現，六味地黃湯可明顯改善5/6腎切除大鼠早期（造模后8周）腎功能和腎臟病理改變，減少腎組織中Ⅰ型膠原、Ⅲ型膠原和纖維連接蛋白的積聚，從而延緩腎間質纖維化[9]。進一步研究還發現，六味地黃湯對5/6腎切除大鼠晚期（造模后12周）亦有很好的治療效果。六味地黃湯可下調5/6腎切除大鼠腎組織中CTGF、PDGF-A、PDGF-B的表達，從而抑制腎間質纖維化[10，11]。但其對HIF-1α、PAI-1蛋白和基因表達的影響尚未闡明。

依那普利是血管緊張素轉換酶抑制劑類藥物，血管緊張素轉換酶抑制劑不僅可通過降壓、減少尿蛋白保護腎臟，還能通過減少腎小球細胞外基質的蓄積，減少腎間質纖維化和腎小球硬化，延緩腎損害進展。因此，本研究選用依那普利作為陽性對照藥物。結果顯示與模型組相比較，六味地黃湯組BUN、SCr及24 h尿蛋白均明顯低于模型組，差異均有統計學意義，且腎臟病理學改變較模型組明顯減輕，說明六味地黃湯可改善晚期慢性腎衰大鼠腎功能，減輕腎間質纖維化程度。與模型組相比較，六味地黃湯組和依那普利組大鼠腎組織內HIF-1α、PAI-1的蛋白水平和mRNA表達明顯升高和降低，且六味地黃湯組升高和降低更明顯，差異均有統計學意義，說明兩種藥物均能抑制晚期慢性腎衰大鼠腎間質纖維化，且六味地黃湯的治療效果優于依那普利。同時，提示六味地黃湯抗腎間質纖維化的作用機制可能與其下調腎組織內HIF-1α、PAI-1的表達有關。

[參考文獻]

[1] Pan SY，Chang YT，Lin SL. The role of hypoxia-inducible factors in renal fibrosis[J]. J Formos Med Assoc，2013，112（10）：587-588.

[2] Kimura K，Iwano M，Higgins DF，et al. Stable expression of HIF-1alpha in tubular epithelial cells promotes interstitial fibrosis[J]. Am J Physiol Renal Physiol，2008，295（4）：F1023-1029.

[3] Ahn YT，Chua MS，Whitlock JP Jr，et al. Rodent-specific hypoxia response elements enhance PAI-1 expression through HIF-1 or HIF-2 in mouse hepatoma cells[J]. Int J Oncol，2010，37（6）：1627-1638.

[4] Higgins DF，Kimura K，Iwano M，et al. Hypoxia-inducible factor signaling in the development of tissue fibrosis[J]. Cell Cycle，2008 ，7（9）：1128-1132.

[5] Takiyama Y，Harumi T，Watanabe J，et al. Tubular injury in a rat model of type 2 diabetes is prevented by metformin：A possible role of HIF-1α expression and oxygen metabolism[J]. Diabetes，2011，60（3）：981-992.

[6] Haase VH. Pathophysiological Consequences of HIF Activation：HIF as a modulator of fibrosis[J]. Ann N Y Acad Sci，2009，1177：57-65.

[7] Kietzmann T，Roth U，Jungermann K. Induction of the plasminogen activator inhibitor-1 gene expression by mild hypoxia via a hypoxia response element binding the hypoxia-inducible factor-1 in rat hepatocytes[J]. Blood，1999， 94（12）：4177-4185.

[8] 何澤云，徐元美. 六味地黃丸治療腎陰虛型慢性腎小球腎炎的臨床研究[J]. 湖南中醫學院學報，2004，24（1）：35-37.

[9] 唐群，何澤云，徐文峰，等. 六味地黃湯對5/6腎切除大鼠腎組織中細胞外基質的影響[J]. 湖南中醫藥大學學報，2012，32（11）：19-23.

[10] 唐群，何澤云，陳麗，等. 六味地黃湯對慢性腎功能衰竭大鼠腎組織缺氧誘導因子1α及相關因子表達的影響[J]. 中國中醫藥信息雜志，2013，20（4）：44-47.

[11] 唐群，何澤云，陳麗，等. 六味地黃湯對慢性腎衰大鼠腎組織中HIF-1α、CTGF表達的影響[J]. 南京中醫藥大學學報，2013，29（3）：342-346.

（收稿日期：2014-11-03）