基于均勻設計法對酸棗仁抗抑郁有效組分的配伍研究

摘要：目的 優選酸棗仁中3種抗抑郁有效組分的最佳配伍比例。方法 根據均勻設計法進行分組，采用小鼠強迫游泳實驗和懸尾實驗，用小鼠不動時間作為藥效學評價指標。結果 酸棗仁抗抑郁有效組分的最優配伍為總脂肪油10mg/Kg，總黃酮100mg/Kg，總皂苷10mg/Kg。驗證實驗證明，酸棗仁抗抑郁有效組分的最佳配伍組合抗抑郁療效確切。結論 應用均勻設計法與藥效學相結合確定酸棗仁活性組分配伍的方法是可行的。

關鍵詞：酸棗仁；抗抑郁；均勻設計

Abstract：Objective To screen out the optimized compatibility proportion of three active ingredients of semen ziziphi spinosae foranti-depression.Methods Groups were arranged following uniform design.The forced swimming test，tail suspension test were carried out to determine theanti-depressantactivity in mice.Mice immobility duration in forced swimming test and tail suspension test were observed.Results The optimized dosage of total fatty oil was 10mg/kg，total flavonoids was 100mg/kg and total saponins was 10mg/kg.Conclusion It would be possible to use uniform design combined with pharmacodynamics method in defining the optimized compatibility of active ingredients of semen ziziphi spinosae.

Key words：Semen ziziphi spinosae；Anti-depression；Uniform design

酸棗仁（Zizyphi Spinosi Semen）為鼠李科Rhamnaceae植物酸棗（Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa（Bunge）Hu ex H.F.Chow）的干燥成熟種子，具有補肝、斂汗、寧心、生津之功效，主要用于治療虛煩不眠、體虛多汗、驚悸多夢和津傷口渴，《本草綱目》將其列為上品。

對酸棗仁的化學成分已有20多年的研究歷史，近年有了較大的突破。酸棗仁富含脂肪油，其中含8種脂肪酸，大部分為不飽和脂肪酸，其它成分有白樺脂酸、白樺脂醇、當藥素、酸棗仁皂苷及阿魏酸、維生素C等，且含多種氨基酸及微量元素[1]。其藥用的物質基礎較受關注的是酸棗仁皂苷A、B、Bl、黃酮苷、酸棗多糖等物質。普遍認為皂苷是酸棗仁的有效鎮靜成分，為三萜類化合物，在結構上與人參、三七等的皂苷類有效成分較為接近。酸棗仁皂苷A的含量明顯大于酸棗仁皂苷B的含量[2]，對不同產地的酸棗仁的種皮、胚乳和子葉中酸棗仁皂苷A和B的含量進行測定，結果表明皂苷A和B主要存在于子葉中。劉沁舡等人以多種色譜方法分離化學成分，鑒定出新化臺物酸棗仁皂苷D[3]。從酸棗仁的乙醇提取物中，用氫氧化鉀和正丁醇處理，分得總皂苷、總黃酮、總酚性成分三部分。對總黃酮進行聚酰胺柱層析，從25%乙醇洗脫液中分得兩種黃酮苷，經化學法和光譜法鑒定為Spinosin和Zivulgarin[4]。尹升鎮等人[5]從酸棗仁中提取分離得到2種生物堿，經理化及UV，IR，1HNMR和MS波譜分析鑒定為Lysicamin和Juzirine，均為首次從該屬植物中獲得。就傳統上不同炮制方法對藥效影響的記載，李正娟等人進行全成分分析發現，生、炒酸棗仁化學成分差別不大[6]。酸棗仁的藥理作用主要有鎮靜、催眠、鎮痛、降溫、降血壓、降血脂、抗驚厥、抗抑郁、抗缺氧、抗腫瘤、抑制血小板凝集、增強免疫功能以及對心臟的保護作用等。隨著分離技術的不斷提高，對酸棗仁化學成分的研究也在不斷深入，更多的藥用成分不斷被發現。對酸棗仁成分進行藥理活性研究，可以闡明酸棗仁的藥理作用和物質基礎，以便更好地利用和開發。

前期研究表明，酸棗仁中抗抑郁作用有效組分為總脂肪油[7]、總黃酮[8]、總皂苷[9]。基于中藥復方協同作用，本實驗采用均勻設計法對酸棗仁中3種抗抑郁作用的主要成分進行配伍研究，篩選出酸棗仁抗抑郁組分的最佳配伍比例。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 雄性ICR小鼠，SPF級，體質量（20±2）g，購于天津市山川紅實驗動物科技有限公司，合格證號：SCXK（津）2009-0001。在飼養環境下適應1w后使用，室溫（22±2）℃，相對濕度65%～70%，光照12h，自由攝食、飲水。

1.2 藥品與試劑 炒酸棗仁（購自天津中新藥業集團有限公司，經天津中醫藥大學中藥學院中藥鑒定教研室張麗娟教授鑒定）自行提取，分離得到總脂肪油、總黃酮、總皂苷。

鹽酸氯米帕明片，北京諾華制藥有限公司產品，批號x0026，規格25mg/片，用前用2%吐溫-80水溶液配制成1mg/mL鹽酸氯米帕明溶液。

5 討論

前期的研究結果表明，酸棗仁中的總脂肪油、總黃酮、總皂苷均具有明顯的抗抑郁活性，因此采用均勻設計方法對酸棗仁中3種主要有效組分最佳配伍進行研究。相比傳統的正交設計法，均勻設計在要考察的因素水平較多時，可減少實驗次數，只需要與因素水平數相等次數的實驗即可達到正交設計的實驗效果[12-14]。

均勻設計的數學原理是數論中的一致分布理論，此方法借鑒了\"近似分析中的數論方法\"這一領域的研究成果，將數論和多元統計相結合，是屬于\"偽蒙特卡羅方法\"的范疇。均勻設計只考慮試驗點在試驗范圍內均勻散布，挑選試驗代表點的出發點是均勻分散，而不考慮整齊可比。它可保證試驗點具有均勻分布的統計特性，可使每個因素的每個水平做且僅做一次試驗，任兩個因素的試驗點點在平面的格子點上，每行每列有且僅有一個試驗點。它著重在試驗范圍內考慮試驗點均勻散布以求通過最少的試驗來獲得最多的信息，因而其試驗次數比正交設計明顯減少，使均勻設計特別適合于多因素多水平的試驗和系統模型完全未知的情況。例如，當試驗中有m個因素，每個因素有n個水平時，如果進行全面試驗，共有nm種組合，正交設計是從這些組合中挑選出n2個試驗，而均勻設計是利用數論中的一致分布理論選取n個點試驗，而且應用數論方法使試驗點在積分范圍內散布得十分均勻，并使分布點離被積函數的各種值充分接近，因此便于計算機統計建模。

均勻設計法的優點：布點均勻，代表性好；試驗次數明顯比其他方法少；可通過計算機給出的定量的數學模型進行處理，分析工藝條件結果的影響；試驗的效益高。

均勻設計是通過一套精心設計的表來進行試驗設計的，對于每一個均勻設計表都有一個使用表，可指導如何從均勻設計表中選用適當的列來安排試驗。均勻設計分會還編制了一套軟件《均勻設計與統計調優軟件包》供試驗設計和數據處理、分析使用，非常方便。均勻設計法的試驗數據分析要用到回歸分析方法，例如線性回歸模型、二次回歸模型、非線性回歸模型以及各種選擇回歸變點的方法，也有利用多元樣條函數技術、小波理論、人工神經網絡模型應用于試驗設計和數據分析，具體選擇何種模型要根據實際試驗的具體性質來確定。利用回歸分析得出的模型，即可進行影響因素的重要性分析及新條件試驗的結果估算、預報和最優化。

整個試驗設計過程一般需要2～3輪次試驗。通常首輪試驗先在較大的條件范圍內進行，初步建立起描述指標和因素見關系的數學模型，計算出模型在一定試驗范圍（原有試驗范圍或較原有試驗范圍適當擴大的試驗范圍）內可預報的最優值和試驗條件組合，然后進行驗證試驗（多是因為最優條件在試驗的邊界或進行了模型的外推計算--在超出原有試驗條件范圍的情況下進行最優指標值和條件的預測計算）以檢驗和修正模型，之后縮小試驗范圍進行下一輪的更為精密的試驗并進一步修正回歸模型。一般通過這樣的2～3輪試驗即可達到試驗目的，不但找到了最優的試驗條件組合而且還建立了可定量描述指標和因素間關系的數學模型。依試驗的目的和支持條件的不同，也可以利用均勻設計的試驗點布點均勻、代表性強的特性，用直接觀察法從所有試驗中挑選表現最好的試驗條件組合而結束試驗設計（不再進行數據的分析處理），或挑選出最好條件后在該條件附近縮小試驗范圍進行更精密些的試驗，直到實現試驗目的而結束試驗。使用均勻設計法進行試驗設計，應盡量采用建模和進行試驗優化分析的方式，透過模型可以對試驗規律有進一步的提高認識，而不應該停留在簡單的指標數值篩選上。

均勻設計法的注意事項：當所研究的因素和水平數目較多時，均勻設計試驗法比其它試驗設計方法所需的試驗次數更少。但不可過分追求少的試驗次數，除非有很好的前期工作基礎和豐富的經驗，否則不要企圖通過做很少的試驗就可達到試驗目的。因為試驗結果的處理一般需要采用回歸分析方法完成，過少的試驗次數很可能導致無法建立有效的模型，也就不能對問題進行深入的分析和研究，最終使試驗和研究停留在表面化的水平上（無法建立有效的模型，只能采用直接觀察法選擇最佳結果）。一般情況下，建議試驗的次數取因素數的3～5倍為好。

優先選用Un*表進行試驗設計。通常情況下Un*表的均勻性要好于Un表，其試驗點布點均勻，代表性強，更容易揭示出試驗的規律。而且在各因素水平序號和實際水平值順序一致的情況下，還可避免因各因素最大水平值相遇所帶來的試驗過于劇烈或過于緩慢而無法控制的問題。

對于所確定的優化試驗條件的評價，一方面要看此條件下指標結果的好壞，另一方面要考慮試驗條件是否合理可行的問題。要權衡利弊，力求達到用最小的付出獲取最大收益的效果。

本研究所用酸棗仁總脂肪油、總皂苷、總黃酮的提取方法是根據此3種有效成分的極性等差異建立的一種系統提取分離法，分別利用石油醚提取法、大孔吸附樹脂分離純化各成分。

本實驗所優選的是抗抑郁作用組分的配伍關系。通過小鼠強迫游泳實驗及小鼠懸尾實驗，考察小鼠強迫游泳實驗及小鼠懸尾實驗的不動時間，作為評價抗抑郁作用的藥效學指標，將藥效學與均勻設計法相結合，應用到中藥有效組分配伍篩選工作中。運用相關軟件分析，得出回歸方程，可觀察到各組分對作用效果的貢獻大小及優化用量的信息。

6 結論

酸棗仁總脂肪油、總皂苷、總黃酮是酸棗仁發揮抗抑郁藥效的有效組分，不同有效組分配伍均有不同程度的抗抑郁效果；最優配伍為總脂肪油10mg/Kg+總黃酮100 mg/Kg+總皂苷10 mg/Kg，其藥效優于藥材組；以均勻設計與藥效學相結合確定中藥有效組分配伍的方法是可行的。

參考文獻：

[1]彭智聰，朱建軍.酸棗仁化學成分及藥理研究進展[J].時珍國醫藥，2001，12（01）：86-87.

[2]王健，林曉.酸棗仁中酸棗仁皂甙A和B的含量測定[J].中藥，1996，27（03）：154-155.

[3]劉沁舡，王邠，梁鴻，等.酸棗仁皂苷D的分離及結構鑒定[J].藥學報，2004，38，（08）：

601-604.

[4]郭勝民，范曉雯，趙強.酸棗仁中黃酮類成分的研究[J].中材，1997，20，（10）：516-517.

[5]尹升鎮，金河奎，金寶淵，等.酸棗仁生物堿的研究[J].中國中藥雜志，1997，22，（05）：

296-297.

[6]李正娟，梁鑫淼，肖紅斌，等.生、炒酸棗仁鎮靜催眠作用及化學成分比較[J].沈陽藥科大學學報，2003，20，（01）：35-37.

[7]趙啟鐸，舒樂新，王穎，等.酸棗仁油對行為絕望小鼠模型的影響[J].中國實驗方劑

學雜志，2011，17（18）：190-191.

[8]趙啟鐸，舒樂新，王穎，等.酸棗仁總黃酮抗抑郁作用的實驗研究[J].天津中醫

藥，2011，28（4）：335-336.

[9]趙啟鐸，舒樂新，王穎，等.酸棗仁總皂苷抗抑郁作用的實驗研究[J].中學，2011，9（7）：489-490.

[10]Porsolt R D，Anton G，Blavet N，et al.Behavioural despair in rats：a new model sensitive to antidepressant treatmeats[J].Eur J Pharmacol，1978，47（4）：379-391.

[11]Steru L，Chermat R，Thierry B，et al.The tail suspension test：A new method for screening antidepressants in mice[J].Psychopharmacology，1985，85（3）：367-370.

[12]徐培平，張奉學，符林春，等.基于均勻設計-偏最小二乘回歸建模的中藥復方配

伍規律研究方法[J].中草藥，2011，42（4）：819-824.

[13]孫曉英，吳瑩，徐慶輝.均勻設計及其在中藥學領域中的應用[J].安徽

藥，2009，13（7）：822-824.

[14]余日躍，吳興華，何雁，等.正交和均勻設計對四物湯配伍體外抗LPO作用比較

[J].中國實驗方劑學雜志，2004，10（3）：46-47.編輯/蘇小梅