半枝蓮多糖對膠質瘤細胞增殖抑制作用和Bcl—2蛋白表達的影響

摘要：目的 研究半枝蓮多糖對膠質瘤細胞增值抑制作用，觀察對Bcl-2蛋白表達的影響。方法 常規培養人膠質瘤 U251 細胞，分別用12.5、25、50、100 μg/mL半枝蓮多糖作用于U251細胞；四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT 法）檢測U251細胞增殖抑制率；Western blot檢測Bcl-2蛋白表達水平。結果 半枝蓮多糖抑制人膠質瘤細胞U251的增殖，抑制作用呈劑量和時間依賴性；隨著半枝蓮多糖濃度的增加，U251中Bcl-2蛋白表達水平呈減少趨勢。結論 半枝蓮多糖可能通過下調Bcl-2蛋白表達，抑制膠質瘤細胞體外生長。

關鍵詞：半枝蓮多糖；神經膠質瘤；細胞增殖；Bcl-2蛋白

半枝蓮（Scutellaria barbata D.Don）為唇形科黃岑屬植物，其中SBPS是從半枝蓮中分離的主要功能性成分之一。研究證明半枝蓮多糖具有免疫調節、抗腫瘤、增效減毒、抗氧化、抗衰老等生物活性[1]。宋高臣等[2]通過SP免疫組織化學染色技術測定HepA瘤細胞中Rb、P16基因蛋白的表達量，實驗表明半枝蓮多糖對HepA瘤細胞增殖的抑制作用可能通過上調抑癌基因Rb、P16的蛋白表達而達到。本研究旨在討論半枝蓮多糖是否對膠質瘤細胞有增長抑制作用，并觀察對Bcl-2蛋白的表達是否有影響，為半枝蓮多糖的抗膠質瘤作用機制尋找切入點打下基礎。

1資料與方法

1.1一般資料 細胞系膠質瘤細胞株 U251 來自中科院上海細胞所，半枝蓮多糖購于寧波德康生物制品有限公司；二甲基亞砜（DMSO）、胰蛋白酶為美國Amresco公司產品；苯甲基硫酰氟（PMSF）為美國Promega公司產品；RPMI-1640 培養基、噻唑藍（MTT）、乙二胺四乙酸（EDTA）、4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）為美國GIBCO公司產品、小鼠抗Bcl-2單克隆抗體為Santa Cruz 公司產品。

1.2方法

1.2.1細胞培養及藥物配置 常規培養膠質瘤U251細胞，收集生長對數期的細胞用于實驗。以DMSO溶解半枝蓮多糖，-20℃貯存，備用。配制12.5、25、50、100 μg/mL的半枝蓮多糖工作液，對照組為完全培養基。

1.2.2 MTT法檢測半枝蓮多糖對U251膠質瘤細胞增殖抑制率 消化 U251 膠質瘤細胞，細胞密度調整至 1×105個/L，接種于96孔板，培養箱內培養24 h。吸去舊培養液，加入終濃度為0（對照組）、12.5、25、50、100 μg/mL的半枝蓮多糖工作液，培養24、48及72 h。加入新鮮配制的MTT，培養4 h，取出，棄上清，加入DMSO，于搖床振蕩10 min，顆粒完全溶解后，應用酶標儀測定吸光度值（A值）。每組設5個平行孔，重復測量3次。計算腫瘤細胞生長抑制率：腫瘤細胞生長抑制率（IR）= （1-B/A）×100%（A、B分別為對照組和實驗組的光密度值）。

1.2.3 Western blot檢測 U251膠質瘤細胞用100 μg/mL的半枝蓮多糖工作液處理48 h，收集細胞，3000 r/min 離心10 min，冰 PBS 沖洗，加入細胞裂解液，冰上裂解1 h，13000 r/min 離心 10 min，收集上清。應用 Folin-酚試劑法測定蛋白含量。加入上樣緩沖液后加熱，凝膠電泳。將蛋白帶轉移至 PVDF 膜，封閉液作用2 h。加入 p53、p21-抗，4 ℃ 過夜。加相應二抗，室溫孵育1 h。以ECL 顯色系統顯色。分析膠片中的蛋白條帶，以各組灰度面積的乘積/內參照（β-actin）灰度面積的乘積反映相對蛋白表達豐度。

1.3統計學處理 應用SPSS 11.0 統計軟件，計量資料多組間比較采用方差分析，計數資料采用χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1噻唑蘭方法（MTT法）測定半枝蓮多糖對膠質瘤細胞增殖的抑制作用 半枝蓮多糖在12.5～100 μg/mL濃度范圍內，均能明顯抑制U251膠質瘤細胞增殖，并隨劑量的增加抑制作用增強，隨作用時間的延長抑制作用增強，見表1、表2；抑制率，見圖1。

2.2半枝蓮多糖對膠質瘤細胞Bcl-2表達的影響 從抑制率來看，50、100 μg/mL的半枝蓮多糖作用較明顯，所以選擇這兩個濃度的實驗組進行Western blot 檢測，結果發現半枝蓮多糖可以下調U251膠質瘤細胞中Bcl-2蛋白的表達，見圖2。

3討論

在腫瘤的防治過程中，尋找高效低毒的抗腫瘤藥物以及抗腫瘤輔助藥物是研究的重要方向，而中草藥在抗腫瘤方面具有其獨特的優勢和巨大的潛力。半枝蓮在臨床上是一種常用的抗癌組方藥物， 常與其他中藥聯合復方治療多種腫瘤[3]，如胃癌、腸癌、肺癌、婦科惡性腫瘤，但其相關的有效成分及作用機制尚不清楚[4]。對于其藥理活性的物質基礎，特別是抗癌機制的研究并不深入，僅見半枝蓮提取物能明顯抑制K562細胞的增殖[5]，半枝蓮醇提物有抗腫瘤活性[6]，本研究實驗結果可以看出半枝蓮多糖對人膠質瘤細胞有增值抑制作用。

細胞凋亡是正常組織細胞精細調節的重要機制。腫瘤細胞的凋亡易感性受多種凋亡基因表達產物相互間的作用影響。bcl-2蛋白是bcl-2家族中重要的凋亡抑制基因，主要通過穩定線粒體膜電位，阻止細胞色素C和凋亡抑制因子的釋放，阻斷Caspase酶活化的上游信號傳遞通路等作用，抑制細胞凋亡，最終導致細胞惡變。

膠質瘤是顱內最常見的惡性腫瘤，具有多質性和浸潤性的特點，手術時往往難以完全切除徹底，且對放療較不敏感，因此，該腫瘤術后復發率高，治療較棘手。腦膠質瘤日前尚缺乏有效化療藥物，患者預后較差，術后平均生存時間<2年。因此開發安全有效的藥物或尋找中西醫結合綜合治療方法，對于延長膠質瘤患者生存期的延長有重要意義。本研究通過Western blot檢測可以看出半枝蓮多糖可以下調U251膠質瘤細胞中Bcl-2蛋白的表達，可為中藥多糖抗膠質瘤作用機制的研究提供新的方向或靶點，為中藥抗腫瘤的研究提供基礎實驗數據支持。

參考文獻：

[1]袁輝，李春江，馬淑霞.半枝蓮多糖對小鼠S_（180）肉瘤抑制作用的研究[J].哈爾濱商業大學學報（自然科學版）2012，28（4）：396-398.

[2]宋高臣，張高坤，公長春，等.半枝蓮多糖對HepA荷瘤小鼠抑癌基因表達的影響[J].中國醫藥導刊，2010，12（6）：1020-1021.

[3]葉華，崔燎.半枝蓮多糖的抗肝癌作用及其機制的研究[J].癌癥進展，2009，7（3）：331-334.

[4]張晶，趙偉杰.半枝蓮多糖對S180荷瘤小鼠紅細胞功能的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（22）：265-268.

[5]鄭永紅，韋曉瑜，龍繼紅，等.半枝蓮的研究進展[J].中草藥，2010，41（8）：1406-1408.

[6]李中華，趙曉芳，余勝民，等.半枝蓮醇提物對肝纖維化大鼠肝組織TGF-β1和TNF-α表達的影響[J].實用肝臟病雜志，2010，13（3）：193-195.編輯/張燕