鵝副黏病毒F基因的克隆和序列分析

摘要：為了深入研究鵝副黏病毒（goose paramyxovirus，GPMV）F基因的功能，利用PCR方法克隆了鵝副黏病毒HN株的F基因，將其與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌DH5α中，經(jīng)PCR鑒定后，對插入片段進(jìn)行序列測定及分析。結(jié)果表明：鵝副黏病毒HN株的F基因全長均為1 662 bp，編碼553個氨基酸，其裂解位點的氨基酸序列為112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117，與已公布的強(qiáng)毒株裂解位點的氨基酸序列相符。

關(guān)鍵詞：鵝副黏病毒；F基因；克隆；序列分析

中圖分類號： Q785；S858.335.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0035-02

收稿日期：2013-09-27

作者簡介：吳民（1964—），男，海南海口人，獸醫(yī)師，主要從事畜牧獸醫(yī)學(xué)方面研究。E-mail：WM8398@163.com。鵝副黏病毒（goose paramyxovirus，GPMV）是影響?zhàn)B禽業(yè)發(fā)展的主要病原之一，它可引起鵝腸道糠麩樣潰瘍、胰腺腫脹且表面有灰白色壞死灶、脾臟腫大并有大小不等的灰白色壞死灶。近年來，該病在我國呈上升趨勢，且感染宿主范圍不斷擴(kuò)大，已有鵝、丹頂鶴、鴿等感染該病毒的報道[1-3]。本研究對以前分離的GPMV的F基因進(jìn)行克隆，并與國內(nèi)外分離株進(jìn)行序列比對和分析，以期為進(jìn)一步研究該病毒的F基因功能和GPMV分子診斷以及基因工程疫苗奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗材料

從疑似感染GPMV的病死鵝中分離到鵝副黏病毒HN株，經(jīng)過凍干后，于海南省動物疫病預(yù)防控制中心獸醫(yī)診斷檢驗科-70 ℃凍存。

1.2病毒增殖

將病毒適當(dāng)稀釋后，經(jīng)尿囊腔接種9～11 d非免疫雞胚，0.2 mL/枚，于37 ℃恒溫箱孵育48 h，棄去24 h內(nèi)死亡胚，無菌收獲尿囊液，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3引物設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank中的GPMV全基因組核苷酸序列，經(jīng) Lasergene 7.10軟件比對和Primer 5.0軟件分析后，設(shè)計1對引物擴(kuò)增F基因，上游P1：5′-TAGTTCGCCTGTCTATCAAA-3′，下游P2：5′-GTGATGCGGTAGAACGGAT3-3′；由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成。

1.4RT-PCR反應(yīng)

將含有GPMV的尿囊液按照Invitrogen公司提供的RNA抽提操作說明書進(jìn)行RNA模板的提取。反轉(zhuǎn)錄按照寶生物工程（大連）有限公司提供的Reverse Transcriptase XL（AMV）反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為：2 μL模板，各50 pmol上、下游引物，各200 μmol/L 4種dNTP，0.5 μL Ex Taq DNA聚合酶，加水至50 μL。PCR反應(yīng)條件為：97 ℃ 0.5 min，53 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行鑒定。

1.5F基因的克隆及鑒定

將新擴(kuò)增PCR產(chǎn)物按一定比例與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞，陽性菌液經(jīng)PCR鑒定后擴(kuò)大培養(yǎng)并抽提質(zhì)粒，重組質(zhì)粒置于-40 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6序列分析

將鑒定的陽性重組質(zhì)粒，送上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。用Lasergene 7.10軟件將所測序列和與國內(nèi)外病毒分離株的F基因序列進(jìn)行相似性比對。

2結(jié)果與分析

2.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

利用設(shè)計的P1/P2引物對GPMV HN株的F基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果獲得大小約為2.1 kb的特異性條帶，與預(yù)計產(chǎn)物大小相符（圖1）。

2.2重組質(zhì)粒的鑒定

菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得大小約為2.1 kb的片段。

2.3序列分析

由序列測定結(jié)果可知，GPMV HN株的F基因全長為 1 662 bp，編碼553個氨基酸。將GPMV HN株的F基因與國內(nèi)外分離株的F基因序列進(jìn)行比對，結(jié)果表明：GPMV HN株和國內(nèi)已分離的GPMV的F蛋白核苷酸序列相似性在963%～97.3%之間，與傳統(tǒng)疫苗株LaSota的核苷酸序列相似性為82.7%，與國外分離株的F蛋白核苷酸序列相似性在34.8%～38.7%之間（表1）；從F基因進(jìn)化樹來看，GPMV HN株與國內(nèi)分離株處于同一分支，而與國外分離株處于不同分支（圖2）。

3結(jié)論與討論

GPMV HN株的分離鑒定再次證明水禽不再僅是禽Ⅰ型副黏病毒的宿主，而且已成為禽Ⅰ型副黏病毒自然感染發(fā)病、死亡的易感禽類。這可能與禽Ⅰ型副黏病毒發(fā)生變異、逐漸適應(yīng)鵝體有關(guān)[4]。宿主范圍的不斷擴(kuò)大，給禽Ⅰ型副黏病毒的綜合防控提出了新的挑戰(zhàn)。

國內(nèi)外研究表明，禽Ⅰ型副黏病毒F蛋白的變異主要發(fā)生于F蛋白N末端信號肽區(qū)（1～32aa）和裂解位點區(qū)（112～117aa），其他部位的氨基酸較保守，且裂解位點區(qū)氨基酸的組成是構(gòu)成副黏病毒毒力的分子基礎(chǔ)[5]。GPMV HN株的裂解位點區(qū)的氨基酸序列為112-Arg-Arg-Gln-Lys-Arg-Phe-117，與國外發(fā)表的強(qiáng)毒株序列112-Arg/Lys-Arg-Gln-Lys/Arg-Arg-Phe-117相符，表明所分離的GPMV HN株為強(qiáng)毒株。基因序列分析發(fā)現(xiàn)該分離株的F基因與GenBank登錄號為AF162714株系的F基因核苷酸相似性為97.1%，氨基酸相似性為97.7%，二者的相似性較高。進(jìn)化樹分析表明兩者處于同一分支，具有較近的親緣關(guān)系，且同屬于強(qiáng)毒株。GPMV HN株與傳統(tǒng)疫苗株LaSota的核苷酸相似性為82.7%，氨基酸相似性為87.4%，二者的相似性較低，進(jìn)化樹上雖屬于同一大分支，但親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，說明HN株與傳統(tǒng)的疫苗株LaSota相比已發(fā)生一定的變異，這可能是造成水禽長期使用傳統(tǒng)的新城疫病毒疫苗后仍暴發(fā)副黏病毒病的重要原因之一。

參考文獻(xiàn)：

[1]秦衛(wèi)紅. 種鵝感染新城疫病毒的診斷[J]. 中國家禽，2012，34（23）：55.

[2]李靜姬，李福軍，梁玉嬉. 丹頂鶴非典型新城疫與大腸桿菌混合感染的診治[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（2）：211-213.

[3]趙揚，郭明萍，鄒年莉，等. 兩株鴿源新城疫病毒的分離鑒定及F基因序列分析[J]. 中國家禽，2012，34（23）：10-13.

[4]張偉，刁有祥，徐福亮，等. 鵝副黏病毒LS-1株的分離鑒定及F基因分析[J]. 西南大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011，33（4）：31-35.

[5]董國英，丁 壯. 鵝副黏病毒F基因的克隆及遺傳變異分析[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2007，27（2）：176-179.