降解組測序與剪切位點分析研究進展

摘要：動植物細胞內都存在大量的microRNA（miRNA），miRNA的功能之一是通過互補指導內切酶切割與之互補的mRNA，對該mRNA進行轉錄后調控。但miRNA與靶基因之間并不是完全互補，所以通過序列計算方式預測的靶基因中假陽性也是很高的。單獨驗證預測的靶基因不能確定是否正確且費時費力，高通量測序與計算預測結合可以很好地驗證和發現miRNA的靶基因。介紹了尋找miRNA靶基因的降解組測序方法，包括降解組測序的方法原理、試驗流程、miRNA靶基因尋找等主要環節。經研究發現，降解組測序已經成為尋找miRNA靶基因的常用方法。

關鍵詞：降解組；miRNA；靶基因；剪切位點；研究進展

中圖分類號： Q754 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0056-04

收稿日期：2013-10-26

作者簡介：崔東亞（1978—），男，河北滿城人，碩士，講師，主要從事分子生物教學與研究。E-mail：dongyacui@163.com。microRNAs（miRNAs）是一類具有特殊功能的小RNA，約為22個核苷酸，具有抑制蛋白質編碼基因的功能[1]，一些莖環結構的RNA在核酸酶的作用下將莖環結構的RNA剪切加工成miRNA。成熟的miRNA與argonaute（AGO）蛋白結合形成沉默復合體，miRNA與靶基因互補，AGO蛋白則催化剪切靶基因，抑制靶基因翻譯蛋白質[2]。

在動物體內RNA剪切活性來自argonaute2 （AGO2），在5′剪切片段留下3′末端羥基（3′—OH），在3′剪切片段留下5′末端單磷酸（5′—p）[3-4]，但是在動物體內已證實的miRNA的靶基因還很少[5-6]。盡管如此，人工構建的siRNA（small interfering RNAs）同樣可以依據miRNA類似的機制，將靶基因沉默，目前已經成為研究靶基因功能的常用試驗技術。

動物的miRNA通常只有部分序列是可以與靶基因完美互補配對的，這段完美互補配對的序列通常是miRNA的第2個至第7個堿基，miRNA中這段與靶基因完全互補的序列為“種子序列”[7-8]。miRNA的3′非種子端序列在一定程度上有增強miRNA對靶基因識別的作用[8]。研究發現，一些非miRNA靶基因也含有1個或多個miRNA結合區域，為了避免非miRNA靶基因也被miRNA剪切，對非miRNA靶基因的保護機制也發生了進化[9-10]，但是當導入1個siRNA/miRNA或敲除1個內源miRNA仍然可以引起很多基因表達變化，這些表達變化的基因中包含miRNA剪切的靶基因[11-13]。

植物中miRNA靶基因研究相對比較多，因為miRNA與靶基因互補的現象非常多，且miRNA切割位點比較固定，通常位于mRNA-miRNA互補區域，從miRNA 5′端算起，切割位點位于第10個和第11個核苷酸之間[14-15]。miRNA調控靶基因的方式也很多，1個miRNA可以調控多個靶基因，同時多個miRNA也可以調控同一靶基因。總之，在研究miRNA功能過程中尋找和鑒定miRNA的靶基因非常有必要。

新一代測序可以一次性測定百萬級的序列，也可以根據不同需要測定特定類型的RNA，是研究轉錄組表達和表達調控革命性的技術革新[11]。近幾年，新一代測序技術被廣泛應用，如尋找新的miRNA[12]。由于植物中miRNA降解靶基因的機制相對比較清晰，所以新一代測序在分析mRNA降解片段中應用較多。借助于高通量測序分析miRNA靶基因的植物有擬南芥、玉米、棉花、草莓、番茄、葡萄、黃瓜、楊樹、紅豆杉、蝴蝶蘭和線蟲等眾多物種[13-23]。

如何獲得miRNA及其降解位點是研究miRNA功能的前提。miRNA通過互補方式識別靶基因，并將靶基因切割。所以，傳統的研究方法是通過計算機預測和后續的試驗驗證[5]，在驗證過程中須要獲得mRNA的5′末端序列；常規方法是通過5′-RACE技術[24-25]，該技術首先利用poly（A）分離得到mRNA，去掉mRNA的帽子結構并加1個5′接頭序列，或者直接在mRNA 5′末端加入接頭。根據接頭序列和oligo（dT）或特定序列，PCR擴增可以獲得mRNA全部或部分序列，通過Sanger測序可以獲得mRNA轉錄起始位點序列。通過 5′-RACE 技術即可以找到mRNA轉錄起始序列[26-27]，也可以用于mRNA的切割序列分離[24]。通常通過miRNA預測靶基因，然后用5′-RACE對預測的mRNA開展剪切位點研究，即尋找或驗證某個特定的mRNA的5′末端序列。

RACE方法是分析RNA末端的常用方法[24]，新一代測序可以測定百萬條序列[28]。將二者結合，能一次性測得所有RNA的末端序列，輔以生物軟件分析末端序列，可以同時驗證所有預測的靶基因[29]。這樣不僅可以大大提高工作效率，而且還可以從降解片段入手尋找新的miRNA[35-36]。

1MmeⅠ內切酶和降解組建庫流程

1.1MmeⅠ是降解組測序重要的酶

降解組分析中的關鍵是如何找到miRNA-AGO復合物切割的mRNA片段，獲得mRNA切割位點序列，無非是獲得切割位點處的序列。3′切割片段是mRNA切割產物之一，其5′末端是單磷酸結構，3′末端具有poly（A）結構。測定這樣的序列，可以發現所有被剪切的mRNA序列。但這樣的序列太長，超出了新一代測序技術的要求。通過化學方法將序列打斷，又會將切割位點序列淹沒在眾多序列之中，造成背景噪音過大。

MmeⅠ從嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus）中分離得到，屬于Ⅱ型限制性內切酶。在非回文DNA序列上，MmeⅠ識別5′-TCCRAC-3′序列 （R 表示 G或 A），在識別位點下游20 bp處將雙鏈DNA切割，并在識別序列留下2個堿基的黏性末端。MmeⅠ的識別序列為5′-TCCRAC（N）20-3′[30]。MmeⅠ可以單一地將DNA的切割序列截取下來，單一測定切割位點序列。所以，MmeⅠ是降解組測序過程中的關鍵酶。

1.2降解組測序技術路線

降解組分析主要分成RNA建庫測序與數據分析2個部分。其中，RNA建庫是RNA測序前的RNA處理過程。RNA建庫很關鍵，測序目的不同，RNA建庫方法也不同[31-32]。根據目的RNA特點，設計特征的RNA建庫路線，富集獲得感興趣的RNA，即富集目的RNA過程中同時也在去除污染RNA。降解組測序RNA處理過程有別于其他類型的RNA處理，降解組測序RNA處理過程的實質是獲得被miRNA切割的 mRNA 產物[33-34]。通常mRNA 5′ 末端具有帽子結構，3′ 端具有poly（A）結構，mRNA被剪切后，形成2種剪切產物，即5′ 剪切片段和3′ 剪切片段。降解組測序就是要提取3′ 剪切片段，3′ 剪切片段的5′ 具單磷酸結構，3′ 末端具有poly（A）結構[34]。根據3′ 剪切片段特定設計RNA建庫流程（圖1）。

1.2.1降解組測序基本設計思路第一，根據poly（A）尾巴可將所有帶有poly（A）尾巴的RNA分離得到，帶有polyA尾巴的RNA主要有完整的mRNA和3′ 剪切片段2種。第二，在3′ 剪切片段5′ 末端加入RNA接頭。完整的mRNA 5′ 末端為帽子結構，3′ 剪切片段的5′ 末端為單磷酸。只有單磷酸結構的RNA可以與5′ 接頭相連接[35]。5′ 接頭序列帶有MmeⅠ識別位點，如擬南芥降解組分中5′ RNA接頭：5′-GUUCAGAGUUCUACAGUCCGAC-3′，粗體標記為MmeⅠ內切酶識別序列[33]。第三，反轉錄RNA為DNA。即根據接頭序列和oligo（dT）將3′ 剪切片段反轉錄為雙鏈DNA序列。第四，酶切獲得3′ 剪切片段的5′ 末端序列（即切割位點序列）。因為在接頭序列中預先引入MmeⅠ識別位點，帶有接頭的序列會被MmeⅠ切割生成40 bp左右的序列（含接頭序列）。第五，在MmeⅠ酶切位點加入DNA接頭。MmeⅠ酶切后，分離酶切序列，在MmeⅠ切割位點處連接雙鏈DNA接頭，如擬南芥雙鏈DNA接頭為5′-TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3′和其互補鏈3′-NNAGCATACGGCAGAAGACGAAC-5′[33]。第六，純化帶有雙鏈DNA接頭的序列，按照新一代測序流程進行測序。

1.2.2降解組測序設計原理通過mRNA的結構特征、miRNA調控靶基因特征以及結合新一代測序技術來實現。將測序數據回帖轉錄組，深入比對分析，如果在mRNA序列的某個位點發現1個回帖比對峰值，該峰值就是候選的 miRNA 剪切位點，于是從試驗中找到了miRNA的作用靶基因。

1.3降解組數據分析基本流程

高通量建庫和測序可以交由測序公司負責處理，因為建庫、測序所需要的試劑和設備非常昂貴，有公司負責建庫和測序相對比較便宜，而且現在的降解組測序技術已經非常成熟，國內也涌現出多家測序公司，甚至一些大型的科研單位自己就可以直接開展測序服務。但降解組數據分析過程則要求科研人員要熟悉miRNA調控切割靶基因的基本過程，尤其是具備一定的數據處理分析能力。

通過降解組分析可以很輕松地發現miRNA的降解片段，而且也可以根據降解片段發現新的miRNA。降解組數據分析基本分為以下幾個過程（圖2）。

1.3.1獲得clean 數據所謂clean數據是指去除測序接頭序列和低質量序列。如果是由公司測序，一般可以直接從測序公司獲得clean數據，將clean數據直接用于下一步分析。但NCBI上下載的數據中有時也有測序的原始數據，利用這

些數據分析之前則須要進行數據預處理，基本過程包括：去除測序接頭序列、去除簡單重復序列、去除帶有不確定堿基的序列、測序質量分析等。結合軟件操作可以輕松實現數據處理，如FASTQ/A Clipper、cutadapt等。

1.3.2序列比對從miRNA數據庫中找到miRNA的序列，與clean數據分別與參考基因匹配，分析每種序列和miRNA的匹配位點。編寫腳本程序，找到miRNA匹配位點附近的降解片段。因為降解片段來自mRNA降解，miRNA與mRNA互補，根據這個特征找到降解片段剪切位置周圍是否有互補miRNA存在。如果存在miRNA，計算miRNA周圍降解片段數量。序列匹配軟件很多，常用的有BOWTIE[36]、SOAP2[37]、BWA[38]等。

1.3.3獲得靶基因如果miRNA互補區域內存在一個明顯的降解片段峰值，則說明該基因很有可能是與之互補的 miRNA 靶基因，通過與周圍噪音相比，確定該基因為miRNA的疑似靶基因。

1.3.4圖片展示將找到的候選靶基因、miRNA和降解片段位置和數量，通過圖展示出來，如常用t-plot展示，t-plot展示可采用R語言繪制；也可以用一般作圖軟件實現如 Excel （圖3）。

2結論與討論

miRNA是一類非常重要的調控小RNA，通過剪切mRNA來調控靶基因的功能，達到調節生理代謝或發育的目的。miRNA及其調控序列的發現，有助于深入了解miRNA的功能。然而，miRNA調控網絡極其復雜，miRNA僅僅通過種子的區域序列就可以達到調控靶基因的功能，所有mRNA可同時受到多種小RNA的調控，或同一種小RNA在同一mRNA上有多個的靶位點，這會給降解組分析帶來一定的困難。同時，近年來涌現出來其他類型的小RNA，如22G-RNA、26G-RNA、piRNA等小RNA[39]。這些小RNA是否直接參與mRNA的調控還不清楚，但果蠅piRNA可以通過與轉座子RNA序列互補，指導內切酶將轉座子RNA切割，阻止轉座子轉座。但在線蟲中，piRNA并不直接參與靶基因的沉默，而是誘導次級小RNA 22G-RNA生成，這些次級22G-RNA調控互補序列沉默，22G-RNA是否直接參與靶基因的切割還不清楚。但有研究發現，一些次級siRNA也可以切割靶基因[40]。小RNA如何調控靶基因一直是研究的熱點之一，其中小RNA參與靶基因的切割是研究的一個方向。現在有多個網站提供miRNA靶基因的預測服務[5，41-43]，但預測的結果需要試驗驗證。理論上降解組測序幾乎可以一次性驗證所有預測的靶基因，可以將預測的靶基因從試驗角度加以證實。降解組測序實質是測定具有一定特征的RNA 5′ 末端序列，這類RNA特征是5′ 末端具有單磷酸且3′末端具有 poly（A）[34]。這類RNA可以是來自miRNA指導的mRNA切割產物，也可以是來自mRNA的分解產物[44]。當miRNA的靶基因表達量不高或mRNA分解產物過高時，非特異性的 mRNA 降解片段容易檢測到，背景噪音過高，會對miRNA靶基因分析帶來困難。但測序技術也在不斷提高，相應分析方法也在升級，高通量測序與數據分析技術已經成為生物試驗中的常規試驗檢測分析方法。

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