1株桑枝分解真菌的篩選、酶學特性及降解能力

摘要：采用剛果紅染色鑒定法，通過以羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）為碳源的分離培養基初篩和以桑枝粉為碳源的復篩培養基復篩，從桑園地邊垛疊腐爛桑枝下土壤中篩選出1株產纖維素酶的真菌P1，并對其酶學性質和對桑枝的降解能力進行了初步研究。結果表明，P1能有效降解桑樹枝條，最適生長pH值為6，最適生長溫度為 32 ℃。產生的纖維素酶為復合酶系，具有濾紙酶（FPAase）、羧甲基纖維素酶（CMCase）和β-葡萄糖苷酶活性。FPAase在發酵4 d活性最高，可達10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出現活力高峰，達18.188 U/mL；CMCase活力變化相對平緩，4～10 d酶活力變化不大，保持在9～11 U/mL之間。FPAase和CMCase均有較好的溫度和pH適應性，在 40～60 ℃ 和pH值4～6的范圍內均有較好活性。以CMC-Na為底物時P1的最大反應速率（Vmax）和米氏常數（Km）分別為0.082 9 mg/（mL·min）和 0.554 5 mg/mL。基于形態學和18S rDNA序列鑒定P1為撕裂蠟孔菌（Ceriporia lacerata）。撕裂蠟孔菌是一種典型的木腐菌。該菌株有較好的酶活性和溫度及pH適應性，能有效降解桑樹枝條。

關鍵詞：桑枝；真菌；酶學特性；降解

中圖分類號： Q939.9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0378-03

收稿日期：2013-10-08

基金項目：江蘇科技大學大學生科技創新計劃。

作者簡介：王娜（1976—），女，山東煙臺人，碩士，副教授，主要從事生物活性物質開發和利用研究。 E-mail：biojustwn@126.com。纖維素是地球上最為豐富的可再生資源和碳水化合物，占植物界碳素總量的50%以上[1-2]。纖維素是一類線狀大分子物質，由葡萄糖以β-1，4-糖苷鍵連接而成，由于高度的水不溶性且外圍又被木質素包圍，除反芻動物瘤胃中的微生物可降解轉化少部分纖維素外，大部分纖維素很難降解為可利用的葡萄糖。栽桑養蠶、繅絲織綢是我國傳統產業，作為產業物質基礎的桑樹（Morus alba L.）附屬物桑枝由于高度木質纖維化，利用率極低，剪伐后的桑枝和其他纖維素類秸稈一樣大多在田間地頭焚燒，或堆積在地頭任其自然腐爛，不僅浪費資源，對環境也有不同程度的破壞。雖然桑枝具有較高的營養、藥用和工業價值[3-5]，在菌類養殖中[6-7]也得到了較好的應用，但利用率僅為10%左右。目前，通過微生物產纖維素酶降解纖維素是最經濟環保的方法。纖維素酶是指把纖維素降解為纖維素二糖和葡萄糖等小分子可溶性物質的一組酶的總稱，主要由3個主要成分組成[8]。自然界中細菌、真菌、放線菌等許多生物體中可產生纖維素酶[9]，已報道的酶菌種就有50多個屬上千個菌株[10]，受到酶活性低等因素的限制。篩選活性高、抗逆性好的纖維素酶，已成為微生物學、環境保護科學、飼料酶制劑工業等多學科研究的熱點。本試驗采用剛果紅染色法從桑園周圍的土壤中分離得到1株具有產纖維素酶活性的菌株P1，通過形態學和18S rDNA分子生物學鑒定的方法，確定其為撕裂蠟孔菌；并對菌株降解桑枝過程中有關酶特性等進行了初步研究，為菌株應用提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

桑枝：春季剪伐時收集健壯生長良好的枝條，剪成5 cm左右小段，50～60 ℃烘箱中烘干，粉碎后過40目篩，備用。

桑園周圍土壤：采自中國農業科學院蠶業研究所（江蘇鎮江），土壤取3處，分別為桑樹根際土壤、桑園地邊垛疊腐爛桑枝下土壤、桑地空隙處土壤。取距土壤表層10 cm左右深處，自然風干后研磨成粉，備用。

1.2培養基

分離培養基：CMC-Na 10 g、瓊脂10 g、無機鹽溶液 100 mL、水400 mL，pH值7。無機鹽溶液（g/L）：MgSO4·7H2O 1.5、（NH4）2SO4 7、KH2PO4 10、CaCl2 1.5、MnSO4·H2O 8.95、FeSO4·7H2O 0.045 7、ZnCl2 0.008 5、CoCl2·6H2O 0018 3。

復篩培養基：桑枝粉50 g、麥麩皮2 g、瓊脂8 g、無機鹽溶液100 mL、水400 mL，pH值7。無機鹽溶液（g/L）：NaNO3 25、KH2PO4 10、MnSO4·H2O 3、NaNO2 1、FeCl3 0.1。

發酵培養基：烘干的5 cm左右長度桑樹枝條500 g，麥麩皮10 g，按照復篩培養基配方加入無機鹽溶液200 mL，拌勻。

1.3儀器與試劑

儀器：9600型紫外可見分光光度計、DHZ-D恒溫振蕩搖床、SW-CJ-1F超凈工作臺、日本三洋高壓滅菌鍋、蔡司熒光顯微鏡等。試劑：均為國產分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司、上海生工生物工程技術服務有限公司；引物合成和測序由上海生工生物工程技術服務有限公司完成。

1.4目的菌株的篩選

各取土壤樣品10 g于滅菌三角瓶中，加入100 mL無菌水，封口后在100 r/min的轉速下振蕩0.5 h。取100 μL該懸浮液均勻涂布在分離培養基上，37 ℃下恒溫培養24 h，樣品重復3次。將長出的單菌落菌株挑出繼續接種在固體分離培養基上培養，重復多次后得純化菌株。將純化菌株點接在分離培養基上24 h，采用剛果紅染色鑒定法[11]染色10～15 min，1 mol/L NaCl溶液洗滌15 min，觀察菌落周圍有無透明圈。若有透明圈則初步證明該菌株具有產纖維素酶的能力，透明圈越大，產酶能力越強。挑選透明圈較大的菌株接種在固體復篩培養基上，37 ℃下恒溫培養，觀察菌株生長情況。挑選能有效以桑枝粉為碳源的菌株進行系列研究。

1.5粗酶液的制備

取1 L三角瓶，裝入300 mL液態復篩培養基（pH值60），滅菌后接入菌株，于32 ℃、110 r/min搖床振蕩培養。定時定點取樣，發酵液在4 ℃、10 000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液。

1.6酶活力測定

濾紙酶（FPAase）活力測定參照李振江等的方法[12]，以粉碎的新華濾紙為底物；羧甲基纖維素酶（CMCase）活力測定參照Agnihotri等的方法[13]，以CMC-Na為底物；β-葡萄糖苷酶活力測定參照周津等的方法[14]，以水楊酸苷為底物。以 1 min 由底物生成1 μmol 葡萄糖所需的酶量定義為1個酶活力單位（U）。

1.7酶學特性研究

1.7.1反應最適溫度將粗酶液在20、30、40、50、60 ℃的不同溫度條件下，在pH值為4.5 的0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液中反應1 h，按照FPAase和CMCase的方法測定酶活力。

1.7.2反應最適pH值分別設置0.05 mol/L的檸檬酸緩沖液的pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，在最適溫度下反應 1 h，按照FPAase和CMCase的方法測定酶活力。

1.7.3CMCase酶學動力學調節底物羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）濃度（[S]）分別為2、3、4、5、6 mg/mL，按 CMCase 活力測定方法測定酶促反應速率[v，mg/（mL·min）]。用雙倒數法作圖，以底物濃度的倒數（1/[S]）為橫坐標，酶反應速率的倒數（1/v）為縱坐標，計算出米氏常數（Km）及最大催化反應速率（vmax）[15]。

3結論

本試驗通過剛果紅透明圈法和纖維素酶活性的測定，從桑園土壤中篩選出1株較為理想的降解桑枝的菌株P1，在桑樹枝粉為主要碳源的固體復篩培養基中，菌株能較好生長。P1為酸性菌，最適生長溫度在32 ℃，最適生長pH值為6。

對該菌纖維素酶活性分析結果表明，該菌產生的纖維素酶屬于復合酶系。在不同發酵時間對酶系中的3種酶活力測定結果：P1的濾紙酶活力在4 d時活性最高，可達到10.695 U/mL；β-葡萄糖苷酶在6 d出現活力高峰，達到 18.188 U/mL；而CMCase活力變化相對平緩，4～10 d酶活力變化不大。P1產生的FPAase和CMCase均有較好的溫度和pH值適應范圍。以CMC-Na為底物，采用雙倒數作圖法計算獲得P1的最大反應速率Vmax和米氏常數Km分別為0.082 9 mg/（mL·min）和0.554 5 mg/mL。

P1降解桑樹枝的能力相對較弱，酶活力較低，但其產纖維素酶具有酶促反應條件溫和、范圍廣等優良性質，有望通過對其基因誘變提高產酶能力。

通過形態學和18S rDNA鑒定，確定P1為撕裂蠟孔菌。發酵試驗表明，菌株P1能夠很好地利用桑枝條，在桑枝條上長出子實體，使桑枝條腐爛變黑。參考文獻：

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