蛹蟲草人工培養技術研究進展

摘要：蛹蟲草是一種重要的食藥用真菌。本文概述了蛹蟲草人工培養技術的研究進展，包括菌種選育、蠶蛹蟲草培養技術、人工固體培養技術、液體發酵培養技術，為蛹蟲草在我國進一步擴大培養提供參考。

關鍵詞：蛹蟲草；人工培養；固體培養；液體發酵培養

中圖分類號： S567.3+50.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0013-04

收稿日期：2013-11-05

基金項目：北京市科學技術研究院青年骨干計劃（編號：201311）；北京市科學技術研究院萌芽計劃。

作者簡介：周思靜（1985—），女，陜西咸陽人，碩士研究生，研究實習員，研究方向為食藥用真菌。E-mail：zhousijing@hotmail.com。

通信作者：劉桂君，博士研究生，助理研究員，研究方向為食藥用真菌。E-mail：Liu_guijun01@163.com。蛹蟲草（Cordyceps militaris）別稱北蟲草、北冬蟲夏草，是蟲草屬的模式菌，分類學上屬于子囊菌門（Ascomycota）糞殼菌綱（Sordariomycetes）肉座菌亞綱（Hypocreomycetidae）肉座菌目（Hypocreales）蟲草菌科（Cordycipitaceae）蟲草屬（Cordyceps）[1]。 蛹蟲草作為一種重要的食藥用真菌，營養成分豐富，除含有蛋白質、氨基酸等營養成分外，還含有多種維生素、磷、鋅、銅、鐵等微量元素及多種藥用有效成分如蟲草酸、蟲草素、蟲草多糖等，使其具有抗腫瘤，抗病原微生物，抗氧化，調節免疫系統，調節內分泌，抗疲勞及對肝、腎和呼吸系統具有保護作用等一系列藥理作用。大量研究表明，蛹蟲草有效成分和含量與冬蟲夏草類似，可作為冬蟲夏草的替代品，而冬蟲夏草與人參、鹿茸并稱為中藥寶庫中的3大補品。目前冬蟲夏草尚不能人工培養，且野生冬蟲夏草資源在逐年下降，無法滿足市場需求。因此，作為冬蟲夏草替代品的蛹蟲草需求量日益增加。由于蛹蟲草對生長環境要求較低，可人工培養，目前已經形成了蛹蟲草人工培養技術、人工固體培養技術、液體發酵培養等3種培養技術。本文綜述了近年來上述3種培養技術的研究進展，以期為蛹蟲草產業化、工業化栽培提供參考。

1菌種的選育

蛹蟲草在培養過程中極易出現菌種退化，進而導致子實體原基減少，出草畸形，產量、質量下降等問題，因此優良菌株的選育和復壯是蛹蟲草培養成功的關鍵。研究認為，導致蛹蟲草菌種退化的原因主要是兩方面，一是菌種的遺傳背景因素，二是外界的不良條件。遺傳背景導致菌種退化的機理有核型改變、基因突變、胞內有害物質積累等，核型改變是目前比較認同的機理。汪虹等為探明蛹蟲草菌種退化的遺傳背景，根據蛹蟲草交配型基因的序列設計3對特異性引物，對收集到的13株蛹蟲草正常菌株和退化菌種進行PCR鑒定；結果表明，3株正常菌株含有MAT-HMG、MAT-alpha兩類交配型基因，判定為異核體；11株退化菌株僅含有MAT-HMG或MAT-alpha交配型基因，判定為同核體；由此作者推測導致蛹蟲草產生不形成子實體的菌種退化的原因之一是核相發生了變化，即異核體變成了同核體[2]。譚琦等研究也表明，菌種退化是因為核相發生變化，由異核型變為同核型[3]。

建立退化菌種的鑒定方法有助于提前淘汰退化菌種，減少經濟損失。目前可根據生理生化特征來鑒定退化菌株[4]。如可根據脫氫酶活性進行鑒定，正常菌株的酶活高于退化菌株；可利用溴麝香草酚藍指示劑法進行鑒定，退化菌株為藍色或綠色。此外，適當的保藏方法有助于防止菌種退化。夏鳳娜等比較了5種保藏條件下保藏半年、1年后菌絲活化的情況以及菌絲活化后的深層培養和固體培養長勢情況，結果表明適合蛹蟲草的最佳保藏溫度為（4±2） ℃[5]。方華舟等研究了保藏溫度、時間及代次對蛹蟲草菌種質量的影響，發現 4 ℃ 保藏1～2個月為佳，10 ℃保藏1個月為佳，菌種傳代以3代內為佳[6]。

菌種選育是篩選蛹蟲草菌株的關鍵，常用方法有菌落形態觀察法、海選法、化學誘變、物理誘變、原生質體融合、基因改良等。孫軍德等通過對比5株蛹蟲草的菌絲形態、生長速率、液體培養生物量和胞外多糖、人工栽培和子實體中活性物質蟲草多糖和蟲草素，篩選出6號菌株，該菌株菌絲的生長速率比其他菌株快，液體培養生物量和胞外多糖含量明顯高于其他菌株，人工培養的蛹蟲草子實體頭部大，子囊殼豐富，顏色橘黃，出草整齊均勻，出草率高，子實體中蟲草多糖、蟲草素含量均高于其他菌株[7]。王蕾等通過對14株蛹擬青霉菌株進行搖瓶液體培養試驗，篩選出蟲草素產量最高的蛹蟲草菌株CM001[8]。在蛹蟲草的化學誘變選育方面，翟景波等采用亞硝基胍誘變，成功選育出1株高產蛹蟲草誘變菌株H4025[9]；莫紅麗利用吖啶橙誘變選育出高產蟲草素的誘變菌株[10]。物理誘變選育是目前蛹蟲草選育中較常見的選育手段，主要包括紫外誘變選育、輻射誘變選育及航天誘變選育。王陶等利用離子束注入誘變，選育出富鍺能力強的蛹蟲草10號菌株，該菌株誘變后的鍺含量高達1 201 μg/g，比誘變前增加了61.25%[11]。李文等采用低能離子束注入，當注入劑量為2.6×1015 ions/cm3時，篩選出15株蟲草素含量較高的蛹蟲草菌株，通過70%乙醇微波-超聲提取，紫外分光光度檢測，15株菌株中蟲草素含量最高可達（11.924±0.063） mg/g，比原始菌株增長了近30%[12]。Das等通過離子束輻照誘變獲得高產蟲草素的蛹蟲草突變菌株G81-3[13]。利用基因手段進行蛹蟲草優良菌種的選育方面，目前雖有一些研究，但取得的成果不是很顯著。熊承慧等報道，利用基因工程方法可以改善蛹蟲草菌株繼代穩定性[14]。周洪英等利用滅活原生質體融合法進行蛹蟲草優良菌株的選育[15]。

2蠶蛹蟲草人工培養技術

1987年梁曼逸等率先以家蠶和柞蠶為寄主培養蛹蟲草，獲得了與天然蛹蟲草相似的子實體[16]。后來蛹蟲草相繼在桑蠶、蓖麻蠶（馬桑蠶）、天蠶、茶蠶、斜紋夜蛾（Spodoptera litura）、煙蚜夜蛾（Heliothis virescens）、豆天蛾、甘藍夜蛾（Mamestra brassicae）、玉米螟蛹等寄主上成功進行培養[17]。

蠶蛹蟲草培養技術主要包括蠶蛹的選擇、接種、培養等步驟。一般選擇化蛹2～4 d的蠶蛹，剔除不良蠶蛹，對蛹體表面進行適當消毒，接種蛹蟲草培養，將消毒接種過的蠶蛹放入培養室，在溫度15～25 ℃、濕度60%～80%、自然光照、通風條件下培養12～20 d，待蛹體長出子實體原基后，置于溫度21～24 ℃、濕度65%～95%、光照12 h/d的環境中，直到子實體成熟。李亞潔等研究了柞蠶蛹蟲草高產條件，結果表明采用孢子分離技術選育菌種保證了蟲草高產；接種液體菌種效果好，硬化率高，產量高；接種劑量在0.3～0.5 mL時蛹體完全僵蛹時間明顯短，產量高；菌絲生長期25 ℃恒溫培養，蛹體完全變硬時改20 ℃恒溫培養，蛹體硬化快，子實體分布均勻，長勢好，產量較高[18]。申鴻等以蛹蟲草菌株YCC-XD-2為目標菌，比較了家蠶蛹、蛾培養基和蛹粉代料培養基上蛹蟲草的生長情況和蟲草素含量；結果表明蛹蟲草菌種在蠶體和蛹粉代料培養基上均生長良好，其中蠶體培養基以蠶蛾培養基上的蛹蟲草生長較好；蛹粉代料培養基以糯米+蛹粉培養基上的蛹蟲草生長較好；蠶體培養基培育的蛹蟲草子實體中的蟲草素含量顯著高于蛹粉代料培養基培育的蛹蟲草，其中蠶蛾培養基培育蛹蟲草子實體中的蟲草素含量高達 21.97 mg/g，在相同培養條件下，蛹蟲草子實體中的蟲草素含量高于菌絲體和培養基質；利用家蠶蛹、蛾培養基可以生產出高品質蛹蟲草[19]。

以蠶蛹為培養基質生長的蛹蟲草中氨基酸總量及人體必需的8種氨基酸總量均高于人工栽培的蛹蟲草，具有一定抗氧化、延緩衰老的作用。蓖麻蠶蛹蟲草中的蟲草素含量明顯高于野生蛹蟲草，而腺苷含量與野生蛹蟲草相當[20]。此外，家蠶在醫學上有許多用途，是一種非常重要的藥用昆蟲，有廣闊的開發前景。因此，將蠶作為宿主接種蛹蟲草菌進行半人工培養以及藥化等方面的研究，為養蠶業開辟了一條效益更好的新途徑，也為蟲草生產提供了新資源。

3人工固體培養技術

蠶蛹雖是蛹蟲草的理想培養基，但其生產具有一定的季節性，且蠶蛹在處理時較為復雜，易染雜菌，因此，尋找合適的有機培養基替代蠶蛹更有利于蛹蟲草的大規模種植。1932年日本的小林等最先成功采用米飯添加其他有機物制成的培養基，成功培養出蛹蟲草子座[1]，此后許多學者開始了蛹蟲草代料人工固體培養技術的研究。

目前，人工固體培養蛹蟲草的培養基是以大米、小麥、高粱米、玉米、豆粉、木屑、棉籽殼粉等為主要基質，并添加其他營養成分，生產周期為45～60 d，且可采用玻璃瓶栽和淺盤栽培。在人工固體培養蛹蟲草過程中，培養基的組分、環境因素及前體物質的添加對蛹蟲草子實體的生長、產量及活性物質含量均有影響。

3.1不同培養基對蛹蟲草人工固體培養的影響

選擇合適的培養基有助于提高子實體產量，增加出草率以及降低生產成本。目前針對培養基優化的研究結果不盡一致，其原因可能是所選蛹蟲草菌株不同、培養條件不同等造成的。張顯科等認為，大米是栽培蛹蟲草的最佳培養基，此外高粱米、小米、玉米渣、蠶蛹等也可代替大米栽培蛹蟲草[21]。馮景剛等研究認為，小麥培養基培養的蛹蟲草子實體干重大，出草質量好，優于大米、玉米、小米等[22]。鐘冬暉等研究認為，以大米為主要培養基，添加麥麩、玉米等混料培養基，更有利于子實體的萌發[23]。王栩等利用大米加豬血作為培養基，可提高蛹蟲草子實體的產量[24]。以大米、小米等作為主要培養基的基礎上，添加一些碳源、氮源等更有利于子實體的萌發、生長。在碳源方面，添加小分子的碳源如蔗糖、葡萄糖；在氮源方面，有機氮源優于無機氮源，有機氮源中蠶蛹粉優于蛋白胨、魚粉、蛋清液。

3.2環境因素對蛹蟲草人工固體培養的影響

在蛹蟲草子實體生長過程中，除了培養基組成對其生長產生影響外，環境因子濕度、溫度、光照、pH值、氧氣等對蛹蟲草菌絲分化、子實體生長都會產生一定影響。

有關光照的研究表明，蛹蟲草菌絲體生長階段不需要光照，強光照對菌絲生長有抑制作用，子實體分化階段則須要適當光照處理。王菊鳳等研究認為，蛹蟲草菌絲體生長要求黑暗的無光條件，子實體分化形成要求光照在150 lx以上，日光燈強光對子實體的生長發育沒有不良影響；自然光光照度與子實體生物量呈負相關；子實體生長過程中，日光燈光照度、溫度與子實體中的蟲草素含量呈正相關；在子實體生長發育過程中，黑暗處理可增加子實體重量和直徑[25]。高曉梅等研究表明，50～100 lx弱光對蛹蟲草原基分化、子實體誘導有促進作用，光強1 000 lx條件下子實體生長好、產量高，橙黃光條件下子實體的質量和產量都有所提高[26]。Chen等研究發現，在子實體生長階段進行12 h黑暗/光照循環交替后，再進行18 h或24 h的光照，比一直進行光照培養更有利于子實體生長[27]。付鳴佳等研究發現，藍光誘導有利于蛹蟲草菌絲體類胡蘿卜素含量的積累[28]。趙博等研究發現，生物磁效應有助于蛹蟲草中活性物質蟲草素、蟲草酸、多糖含量的積累[29]。

杜雙田等報道，蛹蟲草發菌階段的最適溫度為22.7 ℃，轉色階段最適溫度為20.2 ℃，高溫、低溫均不利于轉色；當子實體分化階段溫度為18.1 ℃時，子座雖然生長較慢，但形成的子座粗而長，產量高且商品性好，且適當溫差有利于子實體原基的分化[30]。在蛹蟲草菌絲體生長階段最適pH值為 5.5～6.5，子實體生長階段最適pH值為6.0左右。蛹蟲草生長過程中基質含水量應調控在60%～65%[1]。

3.3添加因子對蛹蟲草生長的影響

植物激素中的2，4-D、檸檬酸銨、秋水仙素、玉米素等，礦物質元素中的K+、Mg2+、Ca2+等以及一些生物素可促進子實體的生長。肖正華研究了不同添加劑（2，4-D、玉米粉、檸檬酸三銨、秋水仙素、鏈霉素）對蛹蟲草子實體生長分化的影響，認為2，4-D、檸檬酸三銨可縮短蛹蟲草的生長周期，提高子實體產量，玉米粉對提高蛹蟲草子實體產量的影響不明顯，秋水仙素、鏈霉素可誘導原基分化，增強培養基的抑菌能力，同時提高子實體產量[31]。步嵐等研究發現，真菌激發子疫霉（Phytophthora sp.）YL粗提物可提高蟲草素含量[32]。張緒璋研究認為，添加中草藥淫羊藿可提高蛹蟲草的蛋白質、氨基酸含量。此外，赤霉素以及吲哚乙酸、玉米素等植物激素均對子實體生長具有促進作用[33]。

4液體發酵培養技術

液體發酵培養一般用來生產蛹蟲草菌絲體，也有報道指出，靜置發酵可生產蛹蟲草子實體。

液體發酵培養技術較人工固體培養技術具有明顯的優點。一是菌絲生長速度快，菌絲體產量高；二是可以提高蛹蟲草的代謝產物（蟲草素、蟲草多糖等）的產量；液體培養克服了直接從蛹蟲草子實體中提取代謝產物勞動量大、耗時多、產量低等缺點；三是便于工業化生產。由于蛹蟲草液體發酵技術的理化條件易于控制、便于機械化操作、生產工藝規范、生產周期短、產品質量穩定、產量高等優點，使得蛹蟲草液體發酵技術受到廣泛研究。研究還表明，液體深層發酵得到的菌絲體不但具有與子實體相當的營養價值及藥用效果，還可以得到胞外多糖等子實體所不具備的營養保健成分。

近年來對蛹蟲草液體發酵培養的研究表明，不同碳源、氮源、碳氮比、無機元素以及培養基溫度、pH值等環境因素對于蛹蟲草菌絲生長和活性物質的產量均有影響。

4.1培養基營養成分

培養基組成直接影響蛹蟲草菌絲體的生長及生物活性物質產量，因此尋找最優的培養基組成一直是蛹蟲草培養研究的重點。由于蛹蟲草菌株篩選的優化指標及采用優化方法不同，所篩選出的最佳營養配方也各有差異。國內外很多學者針對蛹蟲草培養基進行了大量研究，其中大多數是以蛹蟲草菌絲體為篩選指標進行的，此外還有以生物活性物質蟲草素及胞外多糖含量等為指標進行篩選的。

Park等研究認為，蔗糖、玉米粉為蛹蟲草液體培養產菌絲體的最適碳源和氮源[34]。陳晉安等以菌絲體生長為指標，得出最適蛹蟲草發酵的液體培養基組分為蔗糖50 g/L、玉米漿30 g/L、酵母膏 5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 0.5 g/L[35]。牛帥科等以菌體干重為指標，研究認為適合蛹蟲草菌的液體發酵最佳培養基為葡萄糖 53.36 g/L、蛋白胨 26.72 g/L、MgSO4·7H2O 2.20 g/L、KH2PO4 0.5 g/L[36]。文庭池等研究發現，蔗糖、蛋白胨、MgSO4·7H2O、KH2PO4、NAA（萘乙酸）為蛹蟲草生長的最佳碳源、氮源、無機鹽及生長因子[37]。

Mao等研究認為，有利于蛹蟲草蟲草素積累的最佳氮源為蛋白胨，最佳碳源為葡萄糖，當碳氮比為2.65時（42.0 g/L葡萄糖和15.8 g/L蛋白胨），蟲草素含量達到最大值[38]。Shih等研究表明，適合蛹蟲草菌株（cordyceps militaris CCRC 32219）高產蟲草素液體培養的氮源為45 g/L酵母提取物[39]。Cui等研究發現，適合胞外多糖的最優培養基為葡萄糖48.67 g/L、蛋白胨12.56 g/L、KH2PO4 1 g/L、酵母提取物 10 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L[40]。此外，于田田等研究了富硒蛹蟲草液體培養基，認為最適培養基為大豆粉30 g/L、蔗糖 40 g/L、KH2PO4 1.5 g/L、硫胺素50 μg/L、Na2SeO3 12 mg/L[41]。通過對上述文獻進行總結，發現適合蛹蟲草菌絲生長的碳源為小分子碳源，主要為蔗糖、葡萄糖；而氮源方面用得較多的為蛋白胨和酵母提取物。

4.2培養條件

液體培養條件主要涉及培養溫度、pH值、通風量、發酵時間、光照等條件。 鄭婷婷等研究認為，接種量10%（V/V）、初始pH值 7.0、發酵溫度27 ℃、發酵時間4 d為蛹蟲草菌絲體液體培養的最適條件[42]。歐陽召等研究了適合蟲草素積累的蛹蟲草液體培養條件，發現最適條件為pH值 7.0、溫度 25 ℃、光照時間12 h[43]。Kwon等研究發現最適產胞外多糖的蛹蟲草培養條件為24 ℃、pH值自然、200 r/min、1.5 vvm的通氣量[44]。研究還發現，不同波長的光對蟲草素含量、腺苷含量以及菌絲體生長產生重要影響；對于蟲草素積累來說，藍光>粉紅色光>白光、黑暗、紅光；對于腺苷積累來說，紅光>粉紅色光、黑暗、白光、藍光；對于菌絲體生長來說，紅光>粉紅色光、黑暗、白光>藍光[45]。

4.3添加物

液體培養基組成除了基本碳源、氮源、無機鹽成分外，常添加一些添加物以提高蛹蟲草產活性物質的產量。研究發現，在培養基中添加蟲草素的前體物質腺嘌呤、腺苷酸、甘氨酸、精氨酸、L-天門冬氨酸、L-谷氨酰胺可提高蟲草素含量[46]。Mn、Fe、Se、Cu、Zn、Ca等金屬元素及NH+4也有助于蟲草素的生成[39，47-48]。植物油中的葵花籽油有助于胞外高分子聚合物的分泌，橄欖油有助于菌絲體生長；油酸和棕櫚酸能促進胞外高分子聚合物的分泌，亞油酸能顯著促進菌絲體的生長和胞外高分子聚合物的分泌[49]。此外，家蠶蛾油對蛹蟲草菌絲體的生長及胞外高分子聚合物的分泌也有促進作用，并可增加菌絲體中胞內多糖的含量和發酵液中胞內多糖的產量[50]。昆蟲激素中蛻皮激素能促進蟲草素的產生，一定劑量的保幼激素Ⅲ可加快蛹蟲草液體培養過程中的生長代謝，使胞內多糖含量、胞外多糖含量和蟲草素含量的最大值提前出現。植物生長素中萘乙酸對蟲草素提高也有促進作用。

5研究展望

蛹蟲草作為一種重要的、具有較高保健價值的食藥用真菌，對其研究和開發已成為國內外的研究熱點。人工固體培養技術是目前替代蠶蛹蟲草培養技術獲得子實體的市場化培養技術，但在人工固體培養過程中，培養基組成及培養條件是影響子實體質量和產量的關鍵因素。由于液體培養技術具有接種方便、發菌快速、生產期短、易于控制等優點，是目前獲得菌絲體及提取蛹蟲草活性物質的主要培養技術，特別是隨著蛹蟲草中活性物質蟲草素的保健價值和藥用價值被不斷證實，使得市場對于蟲草素產量的需求日趨增加，因此快速、高效獲得蟲草素的液體培養技術具有極大的發展潛力。此外，蛹蟲草菌種的退化問題是蛹蟲草培養過程中的關鍵性技術難題，因此未來可加大對蛹蟲草菌種退化機制的研究，進而選育出高產、穩定以及具有特定功能（如高蟲草素）的蛹蟲草優良菌種。

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