冰核微生物的研究動態及開發應用前景

摘要：冰核微生物是近年來的研究熱點，本文綜述了冰核微生物的研究動態、應用現狀，指出了其研究中存在的不足，提出霧霾的形成與冰核微生物相聯系的觀點，并對冰核微生物開發前景進行了展望，以期為冰核微生物的進一步研究開發提供理論基礎。

關鍵詞：冰核微生物；研究動態；應用；霧霾；開發前景

中圖分類號： Q939.9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0017-05

收稿日期：2014-04-08

基金項目：國家自然科學基金（編號：31260130、41261020）；國家社會科學基金（編號：10CJY015）；青海省自然科學基金（編號：2013-z-902）。

作者簡介：王恒生（1988—），男，安徽合肥人，碩士研究生，研究方向為資源微生物學。E-mail：365553207@qq.com。

通信作者：刁治民，教授，主要從事資源微生物學研究。E-mail：diao_zhimin@126.com。 冰核是引起水由液態變為固態的物質，它可以是無機物、有機物等非生物，也可以是生物[1]。冰核存在是結冰發生的初始條件，因為冰核可作為晶核而凝結水分子，使其整齊排列，進而誘發結冰過程的形成。自然狀態下，當水的溫度高于一定值時，少量水分子開始有序排列成晶格狀，形成同源冰核，并逐漸形成冰晶。理想狀態下的小體積純水在將近 -40 ℃ 才會結冰[2]。冰核微生物作為一種生物冰核可以誘導水的冰點升高，其分布廣泛，可在-5～-2 ℃下形成規則、細膩、微小異質冰晶。目前各國研究者對冰核微生物深入開展了基礎理論和應用研究，在冰核微生物的分布、種類、影響成冰活性的因素、冰核細菌分子生物學及其應用等方面取得了較大的進展。

1冰核微生物的種類及分布

1.1冰核細菌

1972年Schnell等首次在即將腐爛的植物葉內發現一種很重要的成冰核生物源物質[3]。同年，Fresh從即將腐爛的赤楊（Alnus tenuifolia）樹葉中分離出1株在 -5.0～-2.5 ℃ 下具有冰核活性的細菌（ice nucleation-active bacteria，簡稱INA）[4]。1974年，Maki等將這一具有冰核活性的細菌菌株鑒定為丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae），并進行了較為詳細的研究[5]。目前為止，已發現4個屬23個種或變種的細菌具有冰核活性。我國發現的冰核活性細菌分布在3個屬17種或變種中，優勢種類為丁香假單胞菌和草生歐文氏菌（Erwinia herbicola）。

1.2冰核真菌種類及分布

Kieft于1988年首次報道紅臍鱗菌（Rhizoplacachrys oleuca）在-1.9 ℃具有冰核活性[6]。目前已報道了4屬11個種或變種的冰核真菌，除3種為地衣真菌外，其余8種均為鐮刀菌屬（Fusarium）。冰核真菌分布在地衣、巖石表面、昆蟲體內、土壤等，研究證明真菌比細菌冰核抗熱且耐酸堿、抗紫外線能力強，這些重要的生理生化特性已引起科學家的關注，認為冰核真菌比冰核細菌冰核活性穩定，更具開發應用前景[7]。

1.3冰核病毒

研究發現接種黃矮病毒（barley yellow dwarf virus，BYDV）的小麥農作物比對照提高霜凍溫度1～2 ℃，且霜凍溫度與病毒含量成正相關[8]。

其他微生物如硅藻也發現具有冰核活性。

2冰核微生物的研究現狀

2.1冰核細菌的分子生物學研究

目前，關于冰核的分子生物學研究主要是以冰核細菌為研究對象。

2.1.1細菌的冰核基因研究發現冰核的成冰活性是由單個結構基因決定的，每個冰核基因僅含1個開放閱讀框架（ORF），長度4.0～7.5 kb，由一系列的24、48、144個核苷酸重復單位組成，冰核基因中間部分堿基具有周期性重復的特點，每個重復區含24個保守的堿基對，即重復的八肽 AGTGSTLT 相對應的不完整的重復DNA序列[7]，但不是完全保守。目前已對丁香假單胞菌的冰核基因IceC、InaZ，草生歐文氏菌的冰核基因IceE，熒光假單胞菌的冰核基因InaW、InaA，油菜黃單胞菌的冰核基因InaX和菠蘿歐文氏菌的冰核基因等6個編碼冰蛋白的基因作了序列測定分析，發現InaW基因基本上與InaZ相似，InaX的分子序列與InaZ、InaW、InaE基因也具有高度同源性[9]。

2.1.2冰核蛋白冰核形成是由冰核蛋白（ice nucleation protein，INP）誘導的，研究表明冰核活性細菌分泌的冰核蛋白附著于細菌細胞膜上，是一種糖脂蛋白復合物（lipogly coprotein compound），冰核蛋白在細胞中聚合，形成一種成冰核活性很強的蛋白復合物。不同細菌冰核蛋白有相似的一級結構，其一級結構由1個相對疏水的N-末端結構域、1個高度親水的C-末端結構域和中心高度重復的48肽構成，各占序列的15%、4%、81%，其中48肽中含Gly、Ala、Sec、Thr，具有親水性，結構上高度保真，是表現冰核活性的重要模板[7]。不同冰核蛋白都含有1個長度為41～ 68氨基酸殘基的不重復C端和161～203個氨基酸殘基的不重復N端，以及中部960 ～1 296個氨基酸殘基的核心重復區域，該區域分3個不同層次的重復（分別為48、16和8氨基酸重復單元），其中48氨基酸重復單元間具高度相似性，每個48氨基酸重復單元又可進一步分為3個16氨基酸殘基的中度相似性重復單元，16氨基酸重復單元又可進一步分為2個只有8個氨基酸即 Ala-Gly-Tyr-Gly-Ser-Thr-Leu-Thr 的低度重復單元，八肽中特異地富含Ala、Gly、Thr和Ser，因此具有親水性特性，在結構上表現出高度保真性，是表現冰核活性最重要的模板。對冰核基因進行缺失分析發現，N-末端的缺失可引起丁香假單胞菌成冰核活性降低，使其臨界溫度降至-5 ℃以下；C-末端的缺失能使成冰核能力完全喪失；中間重復結構域的連續缺失也能使成冰核能力相應下降[10]。

2.2影響冰核微生物成冰活性的因素

冰核活性細菌基因必須在其外膜表面表達組裝成完整的冰核活性蛋白結酶，且分布達到一定密度后，才在一定溫度下顯示一定的冰核活性。在不同環境中，冰核活性蛋白表達的時間、數量以及活性是不同的。影響成冰活性的因素很多，主要表現在以下幾個方面：

2.2.1溫度冰核活性與溫度呈負相關，超過25 ℃時則成冰活性顯著下降。

2.2.2菌液濃度孫福在等研究發現，當溫度在-7～-2 ℃ 時，冰核活性與菌液濃度呈正相關，當濃度大于108個/mL時冰核活性達到飽和[11]。

2.2.3pH值冰核細菌生長的pH值在5.0～9.0范圍內，最適pH值為7.0。過酸、過堿環境都會破壞其冰核活性。

2.2.4生長階段陳慶森等研究發現分離自楊樹的2株冰核細菌的冰核活性在MPDA培養基的營養組分沒有表現出特殊的要求，都在生長到對數期后期為冰核蛋白的高表達時期，并于穩定期后期活性最高[12]。

2.2.5其他因素冰核細菌和冰核蛋白對重金屬離子、化學試劑、蛋白酶、植物外源凝集素等試劑敏感，對紫外線、放射性元素的照射、抗菌素以及高溫脅迫、臭氧[13]也敏感。

2.3冰核微生物與農作物霜凍關系的研究

2.3.1冰核微生物對農作物霜凍的加劇霜凍是造成農作物減產減收的嚴重災害。長期以來，人們一直認為是低溫導致植物霜凍，但自1972年Schnell等發現在腐爛的植物葉子內有細菌參與冰核的形成后，人們才逐漸認識到霜凍的形成不完全是由低溫引起的，冰核細菌也參與了冰核的形成，二者相互作用[14]。冰核微生物廣泛存在于腐生植物表面，在 -5～-2 ℃ 的條件下誘發植物體內形成冰晶，造成植物霜凍，破壞植物細胞膜結構，致使植物死亡。通常，無冰核細菌附生的植物可在-8～-7 ℃的低溫下正常生長，因此冰核微生物可誘發和加重植物的凍害。

劉建華等利用霜凍模擬試驗與田間試驗研究了玉米、大豆的霜凍機制與從作物上分離得到的2種冰核細菌間的數量關系。當玉米和大豆葉片噴灑有5×108個/mL濃度的冰核細菌時，葉溫-3～-2.5 ℃時就嚴重受害，而對照組則在 -7～-6 ℃ 時才嚴重受害，且霜凍程度與冰核細菌濃度呈正相關[15]。韋建福等從蠶豆、玉米等植物中分離得到12株具有冰核活性的真菌，經鑒定均為燕麥鐮刀菌（Fusarium avenaceum）[16]。鄭國華等以枇杷（Eriobotrya japonica）為試驗材料，在接種冰核細菌后人工降溫，隨著低溫脅迫時間的延長，葉片褐變率不斷上升，相同時間內，冰核細菌處理的枇杷葉片褐變率為無菌組的2～3倍，且溫度愈低，冰核細菌處理的枇杷褐變率愈高[17]。牛先前等研究發現冰核細菌不同程度地加重了凍害脅迫對枇杷果肉細胞壁、線粒體和葉綠體的破壞程度，其中對葉綠體的破壞最為顯著，其次是細胞壁、線粒體[18]。在-3～-2 ℃下，相比于對照組，接種冰核細菌的杏花器官的褐變率隨溫度的降低而加重，花器官細胞膜透性遭受嚴重破壞，細胞中丙二醛（MDA）顯著上升，而MDA是膜脂過氧化作用最終產物，是膜系統受害的重要標志之一。說明冰核細菌是誘發和加重仁用杏霜凍危害的重要因素[19-20]。

2.3.2冰核微生物在農作物上的分布、消長動態研究冰核細菌在植物體上的數量消長變化受降雨量多少、溫度高低、濕度大小影響[21]。當氣溫平均在10～25 ℃，雨量多、濕度大，又逢春末秋初霜凍易發季節時，冰核細菌出現頻率高、數量較多，容易分離到；當平均氣溫高于30 ℃，處于盛夏季節時，冰核細菌分布數量就很少，難以分離到甚至分離不到。此外，人類活動對冰核細菌濃度的變化也可能有重要影響[22]。

目前對冰核微生物分布、消長動態的研究主要集中在細菌方面，研究表明：冰核細菌種類分布受植物種類、地域范圍、氣象因素和不同的制約而有差異。如在黃瓜、番茄和十字花科植物上主要分布P. syringae菌群，而在香蕉和禾本科植物上主要分布著E. herbicola菌群；在云南、廣西亞熱帶地區，冬季發生霜凍季節，主要分布著E. herbicola菌群，其次是P. syringae菌群，而在北方溫帶的春、秋霜凍季節，以熒光假單胞菌類為多，其次是E. herbicola菌群[7]。孫福等在研究了玉米上冰核細菌的消長動態規律，結果發現冰核細菌消長動態變化和數量分布受玉米不同生長發育階段影響，冰核細菌數量在抽雄到成熟期間最多，達到107～108 CFU/g，是拔節至抽雄期數量的100～1 000倍、苗期至拔節期數量的10 000～100 000倍，且冰核細菌數量受玉米不同播期影響顯著，晚期播種（5.0×104 CFU/g）<中期播種（7.9×105 CFU/g）<正常播種（1.9×107 CFU/g）[21]。劉新文等研究發現茶樹上冰核細菌以假單胞菌屬、黃單胞菌屬、歐文氏菌屬為主，且分離自芽葉的冰核細菌數量最多，嫩葉、老葉其次，茶樹品種及不同區域對冰核細菌的分布也是有影響的[23]。

2.4冰核微生物對大氣氣溶膠的冰相核化能力的影響

研究人員已在高海拔地區甚至在平流層和間層檢測到了微生物及其有機體，細菌以氣溶膠的形式在空氣中廣泛存在，是大氣生物氣溶膠的重要組成部分，是一類具活性并可利用營養物質而生長繁殖或能夠在養分匱乏的空氣中存留的氣溶膠粒子。單個細菌的直徑一般在0.3～10 μm之間，與其他氣溶膠成分結合組成細菌氣溶膠，粒徑范圍0.3～100 μm，比大氣細菌的典型尺寸大得多，這可能是因為細菌與更大顆粒例如土壤顆粒、碎片和塵埃結合成細胞叢聚的原因[24-25]，生物氣溶膠是氣溶膠的重要組成成分，能對氣候產生輻射強迫效應，其成核效應對氣候變化的影響也越來越受關注。生物氣溶膠包括細菌、真菌、病毒等微生物粒子、活性粒子如花粉、孢子等，以及由有生命活性的機體所釋放到空氣中的各種質粒（皮毛纖維、皮屑、表皮碎片、植物碎片、蛋白質晶體等）的統稱[26-27]。研究發現生物氣溶膠可作為云凝結核（CCN）或冰核（IN）[28]誘導過飽和水汽凝結成液滴、促使過冷卻水滴發生凍結形成冰晶，改變大氣云的物理和化學過程，對大氣化、大氣降水和微生物地球化學循環產生影響，其中細菌氣溶膠是自然界冰核活性最強的異質冰核[29-30]。Pratt等研究發現云中冰相顆粒1/3的冰晶中含有生物氣溶膠[31]。Levin等利用垂直風洞測試研究了冰核細菌液滴的核化活性，結果發現冰核細菌以接觸核的活性最高，凍結溫度-9～-3 ℃之間[32]。

2.5冰核細菌對水循環的潛在影響

冰核細菌具有高效冰核活性，科學家推測其在大氣云中的異質核化作用可能對大氣降水過程產生顯著影響。Morris等通過不同地點的水樣品中細菌種群組成分析了P. syringae與水循環的相互關系，他們認為水的循環推動了細菌生活史的循環，植物表面或農業生態系統土壤的冰核細菌以氣溶膠形式進入大氣散布云中并輸送到遠距離，作為凝結核核化催化降水事件，然后隨降水在下墊面重新分布，隨后回歸農業生態系統；下墊面系統的選擇性壓力使得各系統中的細菌種類及其物化和生化特性改變，從而形成了冰核細菌在水循環路徑中種群規模不同、空間分布新格局和新特性的菌種[33]。目前生物冰核在水循環過程中作用研究尚存在許多不確定性和未知性，需要更深入和廣泛的探索與研究。

3冰核微生物的應用現狀

3.1食品工業中的應用

冰核細菌用于食品冷凍中，可提高食品的過冷點，從而使食品在較高的溫度下發生凍結，縮短了凍結時間而節省了大量能源。Jingkun等將草生歐文氏菌（Erwinia herbicola）懸浮液加入無菌水中并在-6 ℃進行冷凍試驗，使其過冷點提高到-0.82 ℃，而對照組無菌水則一直保持液態[34]。陳慶森等把冰核活性菌體蛋白碎片應用在基圍蝦（Metapenaeus ensis）的低溫微凍保藏技術中，分別將蝦倒入冰核細菌液 10 mL，置于-3～-2 ℃的冰箱中，20 d后經感官、品質和風味檢測，發現蝦體保存良好，此項技術延長了基圍蝦的保存期，且耗能低[35]。

3.2促凍殺蟲

倉儲害蟲的傳統防治常用熏蒸法或極端溫度處理，前者易殘留在倉儲物上，對人畜造成毒害，后者費用昂貴。而利用冰核細菌防治倉儲害蟲有很大的優點。首先不污染環境，不存在殘留問題，也不會影響儲糧的品質等。其次，在這種小的環境中便于進行人工低溫的控制，防治成本低，易于操作[36]。赤擬谷盜（Tribolium ferrugineum Fadr.）是一種嚴重的倉儲害蟲，自然狀態下不容易結冰，不容易將其消滅。馮玉香等用冰核真菌制劑噴灑蟲體，風干后人工降溫至-4.8 ℃即可使赤擬谷盜體內結冰，而未噴灑冰核真菌的蟲體在 -14.9 ℃ 才結冰，且赤擬谷盜的結冰溫度與冰核真菌濃度呈正相關[37]。楊鳳連等研究了冰核活性細菌對青菜蟲血淋巴系統的影響，結果發現在相對較高溫度下菜青蟲血淋巴免疫力受到破壞[38]。朱紅等分別以噴霧和喂食法在棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）上接種冰核細菌，試驗表明噴霧法接種可在接種 1 d 后使結冰溫度提高5.9 ℃，并在棉鈴蟲化蛹后還能將其結冰溫度提高7.71 ℃，喂食法接種后2 d才出現棉鈴蟲結冰現象，在蛹上僅能使結冰溫度提高0.93 ℃[39]。Mignon等以不同濃度的丁香假單胞菌菌懸液接種2種谷物害蟲（Sitophilus granarius和Oryzaephilus surinamensis），研究發現，2種蟲的死亡率與菌液濃度呈正相關[40]。

3.3人工降雪、滑雪場的應用

1980年，Woerpel以冰核細菌研制成人工降雪催化劑并申請專利。1985年由美國生產的商品名為Snomax的冰蛋白人工降雪催化劑在滑雪場中使用，使雪的維持時間延長、雪質提高，與其他非生物冰核相比，既節省了能源又不污染環境[41]。Snowmax于1994年被首次應用于人工降雪，市場前景十分廣闊。我國也掌握了利用冰核細菌進行人工降雪并進入應用階段。

3.4冰核基因用作報告基因

冰核細菌基因的研究應用是生物冰核領域的研究熱點，已有研究人員將該基因導入大腸桿菌中，并成功表達，使大腸桿菌具有了成冰核活性[10，42]。冰核基因也可以在酵母、細菌和植物中表達，產生蛋白具有冰核活性[43]。因此可使冰核基因作為報告基因，用于細菌、酵母和植物基因的表達調控研究。冰核基因作為一種新型的報告基因，與通常的報告基因相比具有快速、靈敏、經濟、應用范圍廣等優點。

3.5高敏檢測

冰核活性檢測具有靈敏、方便的特點，應用于高敏檢測前景廣闊。將冰核基因轉導到沙門氏菌特異性噬菌體加到待測的食品和水中，可檢測其冰核活性，這種檢測方法快速、靈敏、成功率高[44]，可用于檢測食品和水中的致病性沙門氏菌。梁波等采用冰核蛋白展示系統，將木糖脫氫酶（XDH）高效地表達在菌體表面，結合紫外可見吸收光譜方法，實現了D-木糖的檢測[45]。

3.6冰核蛋白表面展示系統的研究

冰核蛋白最廣泛和最成功的應用是被用作細胞表面展示系統的運載蛋白，由此構建了大量的表達系統并分別應用于蛋白質文庫篩選、環境有毒物質的降解、重金屬吸附、生物傳感器等方面。例如郭恒等將編碼狂犬病毒主要免疫保護性抗原糖蛋白G基因片段融合到丁香假單胞菌冰核蛋白中，構建表面展示載體，轉化大腸埃希菌BL21 （DE3）后16 ℃低溫誘導表達，細胞ELISA試驗結果表明，重組蛋白在大腸埃希菌表面成功展示[46]。研究發現丁香假單胞菌的冰核蛋白能引導外源蛋白定位于乳酸乳球菌的細胞膜上，為乳酸菌表面展示系統的構建提供了新的方向[47]。

3.6其他應用

明亮認為，霜凍和大震間有很好的對應關系與機制對應，通過收集我國歷史上大震前的霜凍數據，發現在每次大地震前，我國都會出現大范圍的霜凍雨雪天氣，經深入分析得出的結論是：震前地殼內應力增加裂縫增多，使大量土壤微生物逸出地表，由于風向使微生物飄向其他地區，這些微生物附生在農作物上，作為細菌冰核提高了作物細胞間水分的過冷卻點溫度，致使大規模霜凍的發生[48]。筆者認為冰凍作為一種大震前兆的應用有待于跨領域深入研究，此項研究為震前預報提供了很好的研究方向。

4存在的問題及展望

4.1存在的不足

自發現微生物的冰核現象以來，經各國學者不斷深入研究，在冰核微生物的研究及其應用等方面取得較大進展，但仍有一些應用中的實質性問題未能得到很好的解決。

4.1.1冰核微生物在大氣科學的研究還不夠深入縱觀冰核微生物的整個研究發展過程，相關的主流研究集中在對其生物學特性研究、防霜技術的應用、食品冷凍、冰核基因導入及降低物質過冷卻點等方面，遠遠偏離了大氣科學，直到21世紀初，科學家們開始再次關注冰核細菌的冰核活性，將其應用研究延伸到了大氣科學領域中，從而產生了一個新興的綜合學科交叉研究領域[49]。研究中存在的疑問還很多，具有很多不確定性，比如如何鑒別已發現的生物冰核種和新種，怎樣直接或間接測定混合相云中的生物冰核數濃度的空間分布，怎樣確定導致大氣活性生物冰核的數濃度以及其對環境因子的影響程度和影響機制等。探求解釋這些科學問題需要各學科間的交叉綜合方法去研究，包括氣象學、微生物學和大氣化學、物理學等。

4.1.2冰核微生物是否對霧霾的形成有誘導作用霧霾成分復雜，受其粒徑、來源、所處氣候條件等因素影響，主要包括有機物、無機物、水溶性無機鹽以及含碳組分，其中水溶性無機鹽和含碳組分是霧霾主要組分，其質量之和超過霧霾質量的50%，且不同時間不同地區的霧霾中的無機元素種類和含量各不相同[50]。霧霾中還含有大量的微生物，如細菌、病毒、霉菌等[51-53]。近日，清華大學生命學院朱聽研究員課題組報道了北京市霧霾天氣中大氣懸浮顆粒物的微生物組分，其中包含 1 300 多種微生物，細菌占80%以上，同時還含有少量的病毒和古細菌。霧霾具有季節性日變化模式：整體上是冬季夜間質量濃度高于白天，夏季白天質量濃度低于夜晚。He等研究發現霧霾濃度具有明顯的季節變化特征，即冬季濃度值最高，夏季最低[54]，這與冰核細菌的分布消長動態相吻合。筆者認為低溫是誘導霧霾形成的必要因素之一，霧霾的產生是否受到冰核微生物在相對低溫條件下的叢聚膠黏作用，使大氣中水、無機物、有機質以及各種污染物聚合在一起而誘導其形成？目前還未見相關的研究和報道。

4.1.3應加強極地冰核微生物的研究與開發嚴寒是極地基本的氣候特征之一，在內陸青藏高原也常年分布著高原雪山與凍土層，其分布的冰核微生物還未深入研究。目前，已經從南極分離到11株具有冰核活性的細菌，其中包括一種新的南極細菌，定名為Pseudomonas sp. KS-1[55]。且與中溫冰核活性生物相比，南極冰核生物具有熱穩定性好、冰核活性強、分布廣和致病性弱等特點[56]。加強對極地冰核微生物的研究與開發將有助于冰核微生物大規模應用邁上新臺階。

4.1.4應加強對真菌冰核的研究真菌冰核基礎理論研究目前還不深入，其具有的獨特特性是細菌冰核所不具備的，如耐酸堿、耐熱，不需脂類、糖類和巰基基團參與即可發揮活性等，真菌冰核的應用更具便利性、操作性，預計應用前景可能會更廣闊，因此，應當加速真菌冰核的研究和開發應用。

4.1.5在食品工業應用中存在的不足將冰核活性細菌應用于食品的冷凍濃縮中不僅可促使冰晶的生成，降低食品的過冷卻點，還可解決因食品黏度大影響固液分離效率等技術難題，這也是該技術將來研究的方向之一，細菌冰核在食品中的應用將日益廣泛。克隆冰核基因并導入到乳酸桿菌、酵母菌等食用級安全微生物中，通過直接應用這些微生物而表達冰核活性，需要對冰核細菌作大量的分子生物學研究。如何確保在食品工業中冰核活性蛋白的高水平表達和冰核細菌活性成分對環境以及人類的安全的影響是當前研究的方向。

4.2冰核微生物應用前景展望

隨著低溫生物技術的發展與改進，冰核微生物將越來越顯現出廣闊的應用前景，它除了應用在冰核蛋白表面展示系統的構建、食品業、體育娛樂業、農業、人工影響氣候演變、促進降雨降雪、分子生物學等領域，還將在醫藥衛生業昂貴生物制品的保藏等方面起著重要的作用，隨著新的冰核微生物的發現和對冰核微生物基礎理論研究工作的推進以及與不同學科間的交叉研究，必將使冰核微生物的應用前景越來越廣闊，也必將使冰核微生物更廣泛地應用于生產實踐中。

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