辣椒疫霉NPP效應子基因家族生物信息學分析

摘要：NPP（necrosis-inducing Phytophthora protein）是一類效應子，在卵菌疫霉屬病原菌中普遍存在，該類蛋白能夠激發植物的防御反應，如引起植物細胞死亡、促使寄主防御基因表達及產生乙烯。利用生物信息學方法對辣椒疫霉（Phytophthora capsici）基因組內的NPP基因家族存在狀況進行分析，并對其氨基酸序列組成、基本理化性質、蛋白質三級結構等進行預測分析，旨在了解其結構特征，進而發掘辣椒疫霉的致病相關基因。結果表明：NPP基因家族有25個成員，其中大部分成員存在多個拷貝。對25個NPP氨基酸序列進行分析發現，其分子量在12.45～88.9 ku之間；對其中15個NPP蛋白進行三級結構預測發現，它們的三維結構類似，其主要的結構元件為α-螺旋和β-片層；構建了25個NPP蛋白的進化樹，進行了分子進化分析。

關鍵詞：辣椒疫霉；NPP基因家族；效應子；生物信息學

中圖分類號： S436.418.1+9 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0028-04

收稿日期：2013-10-02

基金項目：山西省高校科技項目（編號：20121025）；山西省青年科技研究基金（編號：2013021024-6）

作者簡介：馮寶珍（1981—），女，山東臨沂人，博士，講師，主要從事分子植物病理學研究。E-mail：fengbaozhen@126.com。效應子（effector）是病原物產生的各種能夠壓制或平衡寄主防御系統的分子。在侵染過程中，病原物以效應子為關鍵武器突破寄主的防御系統，一方面能減弱寄主抵抗力以成功侵入，另一方面還能利用寄主的養分以利于自身增殖[1-2]。許多病原物都能分泌效應子，在細菌、真菌、卵菌及線蟲中都發現了效應子[3]。病原物中存在的效應子有許多種，包括NPP[4]、無毒基因（Avr）[5]、CRN[6]、PcF[7]、ScR[8]、糖類水解酶、果膠酶、幾丁質酶以及酯酶[7]等，其中NPP（necrosis-inducing Phytophthora protein）也被稱為NLP（NEP1-like protein），此類基因在卵菌、真菌、細菌中普遍存在[8]，但在細菌、真菌基因組內的數量較少，一般為1～4個，而在卵菌基因組中的數量較多，且多數以基因家族形式存在，如在大豆疫霉（Phytophthora sojea）中約有29個，在橡膠疫霉（Phytohthora ramorum）中約有40個[9]。多數植物被NPP蛋白處理后表現為產生乙烯、MAP激酶活化、植保素合成、PR基因誘導表達、胞質Ca2+釋放以及多種雙子葉植物的葉片壞死反應等現象。最早報道的NPP蛋白NEP1來自鐮刀菌（Fusarisum oxysporium），能夠引起雙子葉植物葉片壞死[10]。后來在腐霉（Pythium aphanidermatum）中分離了該類基因PaNie，發現其原核表達產物能使胡蘿卜、擬南芥及煙草等細胞死亡[11]。Fellbrich等研究了Phytohthora parasitica的NPP1基因，發現其原核表達產物能夠誘導歐芹及擬南芥體內產生pathogenesis-related（PR）蛋白、活性氧（ROS）和乙烯，并引起過敏性壞死反應[12]。Keates等用NeP1處理斑點矢車菊、蒲公英、擬南芥，電鏡結果顯示，這些植物細胞壁結構發生了明顯變化，可引起角質層變薄、葉綠體降解等現象[13]。Bailey等分別用NeP1和Phytohthora megakarya游動孢子處理不同生長時期的可可葉片，發現不同生長時期可可葉片的各類抗逆基因表達水平不同，2種處理葉片中的抗逆基因表達模式相似，因此推測NeP1可能是一種感病因子[14]。棉花黃萎病菌（Verticillium dahliae）VdNEP基因的表達產物能使棉花、煙草、擬南芥葉片萎蔫，因此認為VdNEP是棉花與病原物互作過程中的重要誘導因子[15]。敲除細菌Erwinia carotovora ssp. carotovora和E. carotovora ssp. atroseptica的NPP基因后再分別接種馬鈴薯塊莖，發現其毒性明顯下降[16]。研究發現，大豆疫霉（P. sojae）的PsojNIP基因表達是在活體營養向死體營養轉換的過渡時期，并且只能引起雙子葉植物細胞死亡，因此認為該基因在大豆疫霉半活體營養生活過程中起到輔助病原在寄主植物中定殖的作用[17]。目前有人研究了這類蛋白對植物的過敏反應，但是這類蛋白的功能及在植物中的作用模式還是未知的，更沒有足夠的證據證實NPP蛋白對疫霉毒性起重要作用。

辣椒疫霉（Phytohthora capsici）屬于卵菌綱，是一類區別于真菌的真核生物，除了能夠引起辣椒疫病，還能夠引起多種茄科及葫蘆科植物疫病。辣椒疫病是一種土傳植物病害，廣泛分布于世界各地，且發病快、流行廣，易造成作物嚴重損失。大量使用傳統的化學藥劑不僅使病原物產生了藥物抗性，而且造成的農藥殘留更會嚴重威脅人類的生存環境。隨著基因工程及蛋白質組學的迅速發展，從基因和蛋白水平解釋植物病原的致病機理、挖掘致病相關基因、開展抗病育種及研究抗病基因過程勢在必行。隨著辣椒疫霉全基因組測序的完成[9]，有關致病重要基因家族及靶基因預測分析等逐漸成為研究熱點。分析植物病原真菌關鍵致病基因編碼的蛋白質結構及其關鍵功能結構基團的修飾特性，對于探索植物病原真菌致病性變異的機理具有重要的意義。本試驗在前人研究的基礎上，開展與辣椒疫霉致病性變異相關的基因簇大小、組成、亞組劃分及其關鍵基因的研究。

1材料與方法

1.1數據庫

辣椒疫霉基因組序列信息從DOE Joint Genome Institute（http：//genome.jgi.doe.gov/）下載。

雖然有些蛋白質的基本元件個數相同，但它們的α-螺旋、β-片層以及無規則卷曲的長度都存在一定差異，這些相似或者差異可能導致它們家族成員之間功能的多樣性。

3結論與討論

NPP效應子的研究是當前卵菌功能基因組學領域的熱點。NPP效應子基因家族在微生物中廣泛存在，目前已知的微生物有卵菌腐霉屬（P. aphanidermatum）[4]、疫霉屬（Phytophthora spp.）、真菌鐮刀菌（F. oxysporum）、鏈孢霉屬（Neurospora crassa）[21]，以及革蘭氏陽性菌芽孢桿菌（Bacillus halodurans）、鏈霉菌屬（Streptomyces coelicolor），革蘭氏陰性菌歐文氏菌屬（Erwinia）[4]和弧菌屬（Vibrio pommerensis sp.）[22]，這些微生物中部分是植物病原菌，部分是動物病原物，其侵染方式各異，表明NPP蛋白功能的多樣性。目前的研究集中于對部分植物病原NPP基因功能的分析，大部分NPP蛋白的功能都是未知的。據報道，NPP蛋白可參與寄主防御反應，引起寄主的過敏性反應。也有研究表明，有些病原物中的NPP蛋白與病原物致病性有關。本研究對辣椒疫霉NPP基因家族生物信息學進行了分析，為深入開展NPP基因在辣椒疫霉中的克隆、表達分析及生物學功能鑒定等方面的研究提供了重要基礎。

本研究以大豆疫霉NPP基因編碼蛋白為探針，對辣椒疫霉基因組數據庫進行檢索得到了25個NPP蛋白序列，利用相關數據庫和軟件對這些序列進行基因鑒定和蛋白質三級結構預測分析，并構建系統進化樹對該家族不同成員之間的相互關系和演化歷程進行了探討。對發掘辣椒疫霉致病基因、解析其關鍵基因對于探索植物病原真菌致病性變異的機理及開展抗病基因工程研究具有重要的意義。

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