乳酸球菌RL—68生產菌株工業培養基優化工藝研究

摘要：將工業生產產生的副產品餅干渣加入發酵培養基中，通過單因素和正交試驗對乳酸球菌RL-68生產菌種工業培養基進行優化，確定發酵優化條件為：餅干渣105 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7，在培養溫度35 ℃、發酵初始pH值6.5～6.8條件下培養，這時乳酸球菌RL-68活菌數最高，可達7.32×109 CFU/mL。

關鍵詞：乳酸球菌；工業培養基；優化；配方；發酵工藝；正交試驗

中圖分類號： TQ920.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0285-03

收稿日期：2013-10-14

基金項目：國家級大學生創新創業計劃（編號：201210376003、201310376006）；皖西學院研究性學習項目（編號：wxxyx2013062、wxxyx2013074）；安徽省高校自然科學基金（編號：KJ2011B216）。

作者簡介：孫傳伯（1978—），男，安徽桐城人，碩士，講師，研究方向為生物質能工程。E-mail：scb19781979@126.com。乳酸菌是指發酵糖類主要產物為乳酸的一類無芽孢、革蘭氏染色陽性細菌的總稱，凡是能從葡萄糖或乳糖的發酵過程中產生乳酸的細菌統稱為乳酸菌[1-5]。乳酸菌是一群相當龐雜的細菌，目前至少可分為18個屬，共有200多種，除極少數外，絕大部分都是人體內必不可少且具有重要生理功能的菌群，廣泛存在于人體的腸道中。目前，已被國內外生物學家所證實，腸內乳酸菌與健康長壽有著非常密切的直接關系。乳酸球菌是乳酸菌的一種，是工業上尤其是食品工業上的常用菌種，存在于乳制品、發酵植物食品（如泡菜、酸菜）、青貯飼料及人的腸道尤其是乳兒腸道中，具有發酵溫度高、產酸率相對較高、對糖利用率高、發酵時不需通氧氣等優點，在工業生產上具有非常廣闊的應用前景。目前，世界上對于生產乳酸球菌的培養基有很多研究，但使用的多是實驗室試劑，成本較大。本試驗運用工業生產產生的副產品餅干渣和玉米漿來代替生產乳酸球菌的碳源和氮源，探索簡單、低成本、高產量的適用于實際工業生產的發酵培養基[6]。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗菌種與材料乳酸球菌RL-68，由皖西學院生物質煉制技術工程研究中心提供；餅干渣，由桐城雙武食品廠提供；番茄、香蕉、白菜、橘子、蘋果，均購自安徽省六安市南門菜市場。

1.1.2主要儀器722分光光度計，上海精密科學儀器有限公司生產；250B恒溫培養箱，江蘇金壇精達儀器制造廠生產；PHS-3C pH計，上海儀電科學儀器有限公司生產；SW-CJ-1D超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司生產。

1.1.3培養基活化培養基（g/L）：酵母膏 5、蛋白胨 5、葡萄糖 40，pH值6.0～6.5，115 ℃滅菌15 min；種子培養基（g/L）：酵母膏10、蛋白胨10、葡萄糖50、乙酸鈉0.5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCl 0.01、ZnSO4·7H2O 0.2，初始pH值為6.5～6.8，0.1 MPa 下滅菌20 min[7-10]；發酵基礎培養基（g/L）：蛋白胨15、葡萄糖120、乙酸鈉0.5、MgSO4·7H2O 0.2、MnSO4·4H2O 0.01、FeSO4·7H2O 0.01、NaCL 0.01、ZnSO4·7H2O 0.2，初始pH值6.5～6.8，0.1 MPa下滅菌20 min[11-13]；平板計數培養基（MC培養基，g/L）：大豆蛋白胨5、牛肉膏粉5、酵母膏粉5、葡萄糖20、乳糖20、碳酸鈣10、瓊脂15、中性紅0.05，pH值6.0±0.2，0.1 MPa下滅菌20 min[14-16]。

1.2方法

1.2.1培養方法種子培養：發酵培養前，經2次傳代后，挑幾環乳酸球菌RL-68菌體接種于裝有300 mL種子培養基的500 mL三角瓶中，用封口膜封口，37 ℃恒溫靜置培養；發酵培養：500 mL錐形瓶中裝入300 mL發酵基礎培養基，取培養好的種子培養液，按體積分數1%接種量接種，恒溫靜置培養30 h[17-20]。

1.2.2測定方法活菌計數方法：平板涂布法，選擇3個合適的稀釋度，每個稀釋度做3個平皿，菌落數為3個平皿的平均值；菌液吸光度測定方法：722型分光光度計在620 nm條件下比色；pH值測定方法：pH計測定。

1.2.3乳酸球菌的生長曲線按體積分數1%的接種量將種子培養基接種于發酵培養基中，靜置培養，分別于10、12、14、16、18、20、24、26、30 h取樣測定培養基的吸光度（D值）。

2結果與分析

2.1乳酸球菌生長曲線

在種子培養過程中，分別于4、6、8、10、12、14、16、18、20、24、26、30 h取樣測定培養基的D值。由圖1可見，在前8 h，D值沒有明顯的變化，此時乳酸球菌處于延遲期，細胞正合成分裂所需要的物質；在8～12 h D值有升高，在12～18 h D值有明顯的升高，表明菌種生長進入對數期；18 h 后D值基本保持不變，即菌種進入穩定期。為縮短菌種轉入發酵液中的延遲期，選擇種子培養中對數期的培養液較好，故選擇18 h作為接入發酵液的時間。

2.2發酵培養基的單因素試驗

2.2.1發酵培養基中碳氮比的影響試驗采用工業生產副產品餅干渣作為碳源，改變發酵基礎培養基中的碳氮比，基礎培養基中其他組分不變，37 ℃靜置培養24 h后測定活菌數[21-22]。由表1可見，當碳氮比小于5或者高于8時，培養基中活菌數數量級明顯下降，這說明乳酸球菌RL-68對于碳氮源的利用有其自身的最適度，當碳氮比為7時，培養基中的活菌數最高，可達到1.96×108 CFU/mL，故選取碳氮比為7作為優化培養基的最適碳氮比。

3小結與討論

通過單因素和正交試驗，確定最佳發酵培養基和培養條件為：餅干渣105 g/L、蛋白胨15 g/L、番茄汁3%、最適碳氮比7、培養溫度35 ℃、靜置培養18 h，產菌量可達最高，為732×109 CFU/mL。本試驗利用工業生產產生的副產品為主要原料，獲得一個簡單、低成本、高產量、適用于實際工業生產的發酵培養基。但是，本試驗還有待進一步深入研究，如碳氮源固定比例問題是否可根據生產實際情況進一步調整。另外，利用番茄汁和橘子汁發酵得到的活菌數是在同一數量級的，但由于試驗時不是橘子的成熟季節，故選取了番茄汁，在后續試驗中，對生長因子的影響將進一步開展研究。

參考文獻：

[1]金其榮，張繼民，徐勤，等. 有機酸發酵工藝學[M]. 北京：輕工業出版社，1989：338-345.

[2]洪安安，程可可，孫燕，等. 代謝甘油高產乳酸的菌種選育及培養基優化[J]. 微生物學通報，2009，36（8）：1195-1199.

[3]李元莉，呂欣，陳曉紅，等. 功能性乳酸菌發酵劑在食品發酵工業中的應用[J]. 中國乳品工業，2006，34（1）：35-38.

[4]張建友，徐靜波，王軍良，等. 凍干乳酸菌菌種增菌培養基增殖因子的優化[J]. 微生物學通報，2006，33（1）：12-17.

[5]高年發，晉明芬，張健. 玉米粉細菌發酵生產L-乳酸的研究[J]. 農業工程學報，2007，23（6）：233-236.

[6]Sunhoon K W，Pyung C L，Eun G L，et al.以鼠李糖和添加維生素的大豆蛋白水解物培養乳酸菌生產乳酸[J]. 酶與微生物技術，2000（26）：209-215.

[7]諸葛健，王正祥. 工業微生物實驗技術手冊[M]. 北京：中國輕工業出版社，1994：23-24.

[8]張龍翔，張庭芳，李令媛，等. 生化實驗方法和技術[M]. 北京：人民教育出版社，1981：1-3.

[9]李紅，趙春燕. 乳酸鏈球菌素產生菌的篩選初報[J]. 中國釀造，2006（3）：51-53.

[10]呂加平，梁占東，駱承庠，等. 乳酸菌增菌培養基的優化設計[J]. 中國乳品工業，1999，27（3）：12-15.

[11]熊得鑫.厭氧菌分離和鑒定方法[M]. 南昌：江西科學技術出版社，1986：35-37.

[12]朱瑋，潘玲，趙華寶.一株雞源乳酸菌的分離與初步鑒定[J]. 四川畜牧獸醫，2006，33（10）：29，31.

[13]郭云霞，郝慶紅，朱寶成.羊源芽孢益生菌的篩選與Y5-39菌株的鑒定及其耐受性試驗[J]. 華北農學報，2010，25（5）：206-210.

[14]楊潔彬，郭興華，凌代文，等. 乳酸菌：生物學基礎及應用[M]. 北京：中國輕工業出版社，1996.

[15]凌代文，凌代文，東秀珠. 乳酸細菌分類鑒定及實驗方法[M]. 北京：中國輕工業出版社，1999：67-69.

[16]焦瑞身. 微生物工程[M]. 北京：化學工業出版社，2003：106-113.

[17]高年發，孫曉雯，許俊艷，等. 細菌L-乳酸發酵培養基的優化[J]. 中國釀造，2008（4）：30-32.

[18]黃谷亮，秦菊霞，李楠，等. 干酪乳桿菌產L-乳酸發酵條件的研究[J]. 廣西大學學報：自然科學版，2007，32（4）：376-379.

[19]張蘭威，鄂志強，萬海峰，等. 乳酸菌增菌培養基篩選及干燥保護劑的選擇[J]. 中國乳品工業，2000（2）：7-10，18.

[20]葉勤. 發酵過程原理[M]. 北京：化學工業出版社，2005：84-85.

[21]丁紹峰，譚天偉. 豆粕水解液為氮源細菌厭氧流加發酵生產L-乳酸[J]. 過程工程學報，2006，6（1）：77-81.

[22]Hujanen M，Linko Y Y. 溫度和各類氮源對乳酸菌發酵生產L-乳酸的影響[J]. 應用微生物學，1996（45）：307-313.

[23]吳有煒. 實驗設計與數據處理[M]. 蘇州：蘇州大學出版社，2002：103-105.