木霉菌液體發酵對秸稈的降解作用

摘要：以小麥秸稈為唯一碳源，從發酵液中一代一代提取木霉菌，通過測定秸稈降解率，殘余秸稈有機質含量，發酵液中氮、磷、鉀含量，研究木霉菌對秸稈的降解作用。結果表明：通過一代一代的從發酵液中提取木霉菌，其降解能力有所提高，提取到第4代時，降解能力最高，第4代后，木霉菌的降解能力下降。

關鍵詞：木霉菌；液體發酵；秸稈；纖維素降解

中圖分類號： S141.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0283-02

收稿日期：2013-07-17

基金項目：江蘇省黃河故道農業資源開發項目。

作者簡介：屈海泳（1972—），男，安徽宿州人，博士，副教授，從事園藝生理學研究。Tel：（0517）83591025；E-mail：quhaiyong@126.com。農作物秸稈是農業生產的副產品。近年來，隨著農村經濟的發展，傳統的秸稈利用方式逐漸被弱化和淘汰，大量剩余秸稈的處理成為農業生產中凸顯的問題，一些農民采取最簡單的處理方式——焚燒或隨意堆棄，這樣既污染了環境，又浪費了資源。據報道，我國年產各類農作物秸稈達6.5億t，占世界秸稈總產量的20%～30%[1]。目前，有效利用率只占50%，其余部分大多被付之一炬，造成了大量的社會、經濟和生態問題，成為政府關心、社會關注的熱點和難點。充分合理地利用秸稈是農業生產面臨的一個難題。近幾十年來，國內外一直在探索利用物理、化學和生物方法來降解農作物秸稈，其中采用微生物來降解秸稈被認為是一種簡單、經濟、有效的方法，可克服機械粉碎法、熱處理法[2]、化學處理法的不足，成為秸稈降解領域的研究熱點[3]。自然界中，許多細菌、放線菌和真菌能分解纖維素。秸稈中的纖維素含量占絕大部分，想要有效降解秸稈，先要有效分解其中的纖維素。真菌降解纖維素已得到廣泛認可，已報道的對纖維素作用較強的菌株多是木霉屬、曲霉屬、青霉屬、枝頂孢霉屬、漆斑霉屬的。由于木霉屬真菌能分泌完整的纖維素酶系，可完全水解天然纖維素，所以有關專家更傾向研究木霉。姚強用液體搖瓶法從堿性土壤中篩選到降解纖維素的哈茨木霉[4]。木霉菌屬真菌門，廣泛存在于不同環境條件下的土壤中。木霉在生物防治上的抑菌防病特性及其在有機污染生物修復上的作用，使得木霉的研究引起重視。本試驗通過木霉菌液體發酵促進秸稈的降解，由于直接從田間分離或實驗室保存的木霉菌存在著菌種退化現象，達不到理想降解秸稈的目的，所以筆者希望通過一代接著一代的發酵培養，提高木霉菌對秸稈的降解能力。

1材料與方法

1.1材料

試驗菌種：木霉菌實驗室篩選保藏，PDA培養基，孟加拉紅培養基，pH值均自然，121 ℃、0.1 MPa高壓滅菌30 min。

秸稈樣品：小麥秸稈來源于農戶，風干，剪成2～3 cm，經粉碎機粉碎成過40目左右的秸稈粉，烘干至恒重。

1.2主要儀器與設備

超凈工作臺、自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋、電子分析天平、恒溫搖床、恒溫培養箱、電熱恒溫鼓風干燥箱、微型植物粉碎機、可見分光光度計、火焰光度計、擴散皿、微量滴定管。

1.3方法

1.3.1菌種培養取置于實驗室冰箱中的木霉菌，接種到固體培養基上進行種子活化，置于28 ℃恒溫培養箱中培養7 d。

1.3.2孢子液配制取培養5 d的木霉菌平板，加入5 mL無菌水將孢子刮下，取100 μL此懸液，加蒸餾水稀釋一定倍數，在600 nm下測其吸光度，根據吸光度加入適量無菌水稀釋調節至同一水平，備用。

1.3.3秸稈發酵培養取5個250 mL錐形瓶，分別稱取2 g小麥秸稈粉末置于其中，再加入60 mL蒸餾水，混勻，經 121 ℃ 高溫滅菌20 min，待其冷卻，調節pH值為6，然后用移液槍接種上述1 mL孢子液置于其中4個錐形瓶中，剩下一個作為空白不接種孢子液，置于30 ℃、 120 r/min的恒溫搖床下發酵培養7 d。發酵結束，用移液槍移取100 μL此發酵液，均勻涂于平板上，置于上述相同環境下培養，將第1次從發酵液中提取出培養的菌稱為1代菌；將錐形瓶充分搖勻，取適量發酵液，待測定其中養分含量。再次取5個上述相同容量錐形瓶，加入同樣質量的新的秸稈和蒸餾水，相同處理，將1代菌種接入其中發酵培養，如此一直繼代培養，依次將得到2、3、4、5、6代菌，以冰箱中取出的木霉菌作為對照。

1.3.4測定項目與方法發酵結束后殘余秸稈有機質含量的測定采用K2Cr2O7-H2SO4外加熱法；發酵液中氮含量（以銨態氮含量計，下同）的測定采用堿解擴散法；發酵液中磷含量的測定采用鉬酸銨-分光光度法；發酵液中鉀含量的測定采用火焰光度計測定法；秸稈降解率的測定：將降解過的秸稈粉過濾沖洗，除去菌體，105 ℃烘干至恒重，以不接菌的為對照，失重法計算秸稈降解率。

1.3.5數據處理數據處理與統計分析用Excel 2003和SPSS軟件進行。

2結果與分析

2.1秸稈發酵前后顏色變化

經高溫滅菌后，于錐形瓶中接種1 mL孢子液，結果（圖1-A）發現，該錐形瓶中上層溶液具有一定透明度，且顏色呈紅棕色。發酵后7 d（圖1-b），靜置一段時間后發現，該發酵樣品的上層溶液顏色變成土黃色，且溶液渾濁。與加入木霉菌溶液相比，對照（不加木霉菌）上層溶液仍具有一定透明度，渾濁度相對較低。

2.2各代木霉菌對秸稈降解率的影響

從表1可以看出，木霉菌液體發酵對秸稈的降解具有一定的顯著效果，只是各代菌種的降解效果不同。從發酵液中提取出的木霉菌降解效果顯著好于對照，當提取到第3、第4代時，其降解率到達最大，為19.35%；再提取到第5、第6代時，其降解率略有下降，其中6代菌下降最明顯。

3結論與討論

本試驗采用木霉菌降解秸稈，秸稈在發酵7 d之后，量均有減少，說明木霉菌能有效降解秸稈。其中，3、4代菌的降解率較高，比對照高6.99%，通過一代一代的從發酵液中提取木霉菌，提高了秸稈降解能力，但也不是次數越多越好，當提取到第5代時，秸稈降解率略有下降，到第6代時下降更明顯。從本試驗結果可知木霉菌提取一定次數后，其降解能力會下降，這與楊小麗的試驗結果[6]類似，通過對菌種一直繼代培養，淘汰培養過程中降解能力下降的菌株，選擇降解能力強的菌株。盧松通過研究微生物對玉米秸稈的腐解，得出秸稈的發酵過程是有機質不斷分解的過程的結論[7]，與本研究結果一致，即有機質含量變化與秸稈降解率變化基本一致。

通過具體分析各代菌發酵液中氮、磷、鉀含量的變化趨勢可以得出，整體養分含量通過對木霉菌的多次提取有所提高，提高的趨勢雖不同，但是當提取到第4代時各養分含量都達到最大值，分別為89.95、49.29、134.26 mg/L。與對照相比，養分含量分別提高了31.75、12.26、31.53 mg/L，但是當繼續提取下去時，各養分含量均略有下降，與秸稈降解率的變化趨勢相同。本研究結合各養分含量與秸稈降解率的變化趨勢得出，4代菌的降解率最高，且其各養分含量均達到最高。

參考文獻：

[1]曹玉鳳，李英，劉榮昌，等. 生物技術在處理農作物秸稈飼料中的應用[J]. 飼料研究，1999，22（1）：27-28.

[2]楊雪霞，陳洪章，李佐虎. 玉米秸稈氨化汽爆處理及其固態發酵[J]. 過程工程學報，2001，1（1）：86-89.

[3]王淑軍，揚從發，陳靜. 用于降解秸稈的纖維素酶產生菌的篩選研究[J]. 糧食與飼料工業，2001（12）：21-23.

[4]姚強，黃琰，陳冠軍. 哈茨木霉SDU3.87耐堿性纖維素酶液體發酵條件的研究[J]. 山東大學學報：理學版，2005，40（3）：110-115.

[5]史央，戴傳超，吳耀春，等. 植物內生真菌強化還田秸稈降解的研究[J]. 環境科學學報，2004，24（1）：144-149.

[6]楊小麗. 秸稈降解菌的選育及復配研究[D]. 鄭州：鄭州大學，2009.

[7]盧松. 微生物處理玉米秸稈的腐解特征研究[D]. 重慶：西南大學，2010.