甜瓜霜霉病抗性基因的SSR標(biāo)記

摘要：為了研究與甜瓜抗霜霉病基因緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記，以甜瓜抗病品種PI414723和感病品種DF4的雜交F2群體156個(gè)單株為試驗(yàn)材料，利用人工鑒定方法，根據(jù)F2抗、感病單株分離比例組建抗感池，用SSR技術(shù)尋找與抗病基因連鎖的分子標(biāo)記。從211個(gè)SSR引物組合中篩選出3個(gè)與抗病基因緊密連鎖的標(biāo)記DE1887、DE1320、DM0854，遺傳距離分別為26、26、13.69 cM。

關(guān)鍵詞：甜瓜；霜霉病；SSR；遺傳距離；抗性基因

中圖分類號(hào)： S436.5 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）07-0054-02

收稿日期：2014-03-09

基金項(xiàng)目：現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（編號(hào)：CARS-26-01）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（編號(hào)：2012BAD02B03）。

作者簡(jiǎn)介：賀玉花（1989—），女，河南焦作人，碩士研究生，主要從事蔬菜遺傳育種研究。E-mail：heyuhua2007@126.com。

通信作者：徐永陽(yáng)，研究員，碩士生導(dǎo)師，主要從事蔬菜遺傳育種等方面的研究。Tel：（0371）65330930；E-mail：xuyongyang@caas.cn。霜霉病（Psedoperonospora cubensis）是甜瓜、黃瓜和南瓜等葫蘆科作物上廣泛發(fā)生的一種世界性病害。該病害在溫室種植的瓜類上全年發(fā)生，在露地條件適宜時(shí)也不斷發(fā)生。此病一旦發(fā)生，病情擴(kuò)展很快，通常控制不住，成片病葉迅速枯焦，導(dǎo)致果實(shí)不能成熟，嚴(yán)重影響甜瓜的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。為了減輕病害的發(fā)生，長(zhǎng)期施用農(nóng)藥不僅污染環(huán)境，威脅到人們的身體健康，而且還會(huì)導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生抗藥性，因此培育抗霜霉病的優(yōu)良品種是防治瓜類霜霉病的根本途徑；但傳統(tǒng)的育種方法所需時(shí)間較長(zhǎng)，不能滿足甜瓜生產(chǎn)對(duì)新品種的需求。隨著分子生物學(xué)的日益發(fā)展，利用 RFLP、AFLP、RAPD和SSR等分子標(biāo)記技術(shù)尋找與抗病基因緊密連鎖的分子標(biāo)記，從而進(jìn)行抗性鑒定和標(biāo)記輔助選擇育種。在印度發(fā)現(xiàn)了很多抗霜霉病的優(yōu)良材料，例如PI124111、PI124112和PI414723。PI124111和PI124112成為了美國(guó)抗霜霉病育種的背景材料，許多學(xué)者對(duì)這2個(gè)材料的抗病遺傳規(guī)律和抗霜霉病相關(guān)基因進(jìn)行了相關(guān)研究[1-4]。2005年，Perchepied等構(gòu)建了第一張也是目前為止唯一一張關(guān)于甜瓜霜霉病的遺傳圖譜，他們利用PI124112×Védrantais獲得的120個(gè)RIL株系為材料，構(gòu)建的圖譜長(zhǎng)度為1 150 cM，包含465個(gè)AFLP標(biāo)記、17個(gè)SSR標(biāo)記、26個(gè)IMA標(biāo)記和2個(gè)重要的形態(tài)標(biāo)記（雌雄同株和抗番木瓜環(huán)斑病），分36個(gè)連鎖群，平均標(biāo)記間距4.2 cM，標(biāo)記最大間距26.5 cM，該圖譜定位了11個(gè)與霜霉病抗性基因相關(guān)的QTL[4]。2012年，楊柳燕等利用抗病品系DM3×感病品系DF4獲得的F2和BC群體為材料，利用軟件對(duì)田間調(diào)查和分子標(biāo)記結(jié)果進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果顯示1個(gè)SRAP標(biāo)記me8em11與甜瓜霜霉病抗性基因的連鎖距離為9.8 cM[5-6]。本研究以抗性品系PI414723為材料，利用BSA方法篩選與甜瓜抗霜霉病緊密連鎖的SSR分子標(biāo)記，為甜瓜抗霜霉病的分子輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

以中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹研究所西甜瓜資源課題組提供的甜瓜抗霜霉病品種PI414723為母本，甜瓜育種課題組提供的感病自交系DF4（在田間和人工接種鑒定時(shí)表現(xiàn)為高感甚至死亡）為父本，及其F2代的156個(gè)單株為試驗(yàn)材料。2012年11月，將試驗(yàn)材料在三亞基地種植：PI414723為10株，DF4為10株，F(xiàn)2代為156株。

1.2抗病鑒定方法

病原菌由三亞基地田間感病黃瓜病葉上采集得到，接種方法借鑒楊柳燕的方法[5]。在傍晚，于植株下部隨機(jī)選擇3張葉片，將準(zhǔn)備好的霜霉菌懸浮液噴灑在葉片背面，直到菌液在葉片上可以成股流下。接種3 d后進(jìn)行病情鑒定，參照翁祖信等的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7]，以葉片背面霉層的覆蓋面積為統(tǒng)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)，最終以單株上的3張葉片病情的平均值作為這個(gè)單株的病情級(jí)數(shù)。

1.4DNA提取方法

DNA提取采用改良的CTAB法，并用核酸蛋白質(zhì)檢測(cè)儀進(jìn)行檢測(cè)。取D280 nm/D260 nm比值和D260 nm/D230 nm比值在 1.80～2.00 之間（ 雜質(zhì)較少） 的DNA稀釋至50 ng/μL。

1.5建立抗感池

從F2代群體中選取6株病害級(jí)別為0的單株和6株病害級(jí)別為5的單株，提取DNA檢測(cè)后進(jìn)行等量混合，建立高抗池和高感池。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取與多態(tài)性引物鑒定

所提取的DNA經(jīng)過核酸蛋白儀檢測(cè)，D280 nm/D260 nm比值和D260 nm/D230 nm比值均在1.80～2.00之間。經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)（圖1），帶型整齊一致，無降解現(xiàn)象，滿足PCR反應(yīng)的要求。

本試驗(yàn)用211個(gè)SSR引物分別對(duì)抗、感親本進(jìn)行篩選，其中136個(gè)引物在抗、感親本之間顯示出多態(tài)性。用在親本中篩選出多態(tài)性的136對(duì)引物分別在抗、感池中進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)了6個(gè)引物在抗感池中表現(xiàn)出多態(tài)性。圖2為9對(duì)在親本中具有多態(tài)性的引物在抗感池間的擴(kuò)增電泳圖，其中斜箭頭所指引物為DE1320，抗病池帶型與抗病親本一致，感病池與感病親本的帶型一致，表示該引物在抗感池中有差異的引物。

2.2甜瓜抗霜霉病基因與SSR標(biāo)記的連鎖分析

用篩選出的6個(gè)引物對(duì)PI414723×DF4的F2代群體的156個(gè)單株進(jìn)行SSR擴(kuò)增，通過QTL IciMapping軟件對(duì)分離群體單株的抗病性和分子標(biāo)記的分離數(shù)據(jù)進(jìn)行連鎖分析，結(jié)果表明：DE1887、DE1320、DM0854與抗霜霉病基因的遺傳距離分別 26、26、13.69cM。

3結(jié)語(yǔ)

世界上對(duì)甜瓜霜霉病的抗病遺傳研究較早，迄今為止，已報(bào)道的甜瓜霜霉病抗性基因有Pc-1、Pc-2、Pc-3、Pc-4、Pc-5[1-3，8]。其中，本試驗(yàn)中所用的抗性親本材料PI414723的抗霜霉病性狀由單顯性基因控制，命名為Pc-3[8]。本研究發(fā)現(xiàn)了3對(duì)SSR引物與PI414723中抗霜霉病基因連鎖，期望通過這些引物獲得更多的關(guān)于基因Pc-3的信息，為以后的甜瓜抗霜霉病遺傳育種提供理論基礎(chǔ)。

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