不同農作物根際自生固氮菌分離及固氮酶活性

摘要：為了解高海拔地區農作物根際土壤自生固氮菌分布及優勢菌株情況，以未施肥的油菜、玉米、青稞、小麥4種農作物種植點為采樣地，對作物根際土壤自生固氮菌進行分離提純，并根據其固氮酶活性篩選固氮能力較強的菌株。結果表明：油菜根際自生固氮菌數量較多，其固氮能力較其他3種作物更高，其中固氮性最好的菌株為德克斯氏菌屬（Derxia spp.）菌株。

關鍵詞：自生固氮菌；林芝；固氮酶活性；農作物；根際

中圖分類號： S144.5 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0385-02

收稿日期：2013-10-14

基金項目：西藏農牧學院青年科研基金（編號：XZ-20130625）。

作者簡介：李文鳳（1982—），女，陜西吳起人，碩士，講師，主要從事土地資源與空間信息技術研究。Tel：（0894）5821066；E-mail：lwf1029@126.com。隨著生活水平不斷提高，人們對于飲食的衛生、安全、保健性更加注重，使生產者更加注重農業產業結構調整，因此產生了有利于環境保護和食品安全的農業生產即綠色農業。在種植方面，應采取生物方法防治病蟲害，減少化肥、農藥使用量，降低其殘留度，通過改善農產品生產環境加快發展綠色食品、有機食品。目前，微生物肥料在農業領域越來越受到關注[1-2]，我國正致力于推廣微生物肥料。固氮菌肥屬于微生物肥料，在自然界氮循環中起著重要作用，施用固氮菌肥可提高土壤有效氮素、增加農作物產量[3-4]。 本研究以未施肥土壤的作物根際微生物為對象，分別對油菜、青稞、小麥、玉米的根際土壤自生固氮菌進行分離，測定其固氮酶活性，并篩選出具有高效固氮性的菌株，以期為固氮菌的有效利用提供參考。

1材料與方法

1.1土壤采集

供試土壤采自于西藏大學農牧學院實習基地農場。西藏大學農牧學院位于西藏林芝地區八一鎮，海拔2 900 m，屬熱帶濕潤和半濕潤氣候，年降水量650 mm左右，年均溫度 8.7 ℃，土壤顯中性偏弱酸性（pH值6.5～7.0），有機質含量35%，全氮含量0.053%，速效磷含量9.9 mg/kg，速效鉀含量26.8 mg/kg。采集非豆科類作物青稞、小麥、玉米、油菜的根際土壤，裝入滅菌袋中，每個采樣袋須記錄采樣環境、時間、日期、類型。及時分離土樣，若不能及時分離應將土樣保存在4 ℃冰箱內，并在2～3 d內盡快完成所有土樣分離。

1.2培養基和主要儀器

自生固氮菌分離、培養分別采用固體、液體無氮培養基。無氮培養基：葡萄糖10 g、磷酸二氫鉀0.2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸鈣0.2 g、氯化鈉0.2 g、碳酸鈣5 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 L，調節pH值為6.5～7.0，121 ℃滅菌備用。液體培養基即上述培養基的液體培養基（不加瓊脂）。

主要儀器：超凈工作臺、恒溫培養箱、氣相色譜儀、微量移液槍、冰箱、電子天平、顯微鏡、乙醇燈。

1.3自生固氮菌的分離和純化[5]

1.3.1根際土壤自生固氮菌分離稱取作物根際土壤10 g，放入滅菌后的三角瓶，加入95 mL滅菌水（0.85%生理鹽水或蒸餾水），200～250 r/min振蕩15 min，在無菌操作臺中靜置15 min，用移液槍吸取上層清液為試驗菌液。吸取0.5 mL菌液注入4.5 mL 85%生理鹽水中，振蕩搖勻即稀釋成10-1溶液；再從10-1溶液吸取0.5 mL菌液注入4.5 mL 85%生理鹽水中，振蕩搖勻即稀釋為10-2溶液，依次可稀釋至10-3、10-4、10-5、10-6溶液。用無菌玻璃棒把經過稀釋的菌液（10-3、10-4、10-5、10-6溶液）均勻涂在固體無氮培養基平板上，在28 ℃培養箱中倒置培養7～14 d。采用平板計數法統計土壤中自生固氮菌的數量。

1.3.2根際土壤自生固氮菌純化挑取少量菌液在固體無氮培養基上劃線分離培養，培養后挑取單個菌落轉接在斜面固體無氮培養基上，待菌落長出保存于4 ℃冰箱備用。

1.4菌株鑒定

1.4.1菌落外觀特征通過劃線培養觀察單個菌落的外形特征。單個菌落為半透明圓形，乳白色，表面濕潤光滑，中間凸起呈黏稠狀。

1.4.2革蘭氏染色觀察選擇劃線培養的菌落，用草酸銨結晶紫染色1 min，水洗后加碘液覆蓋再染色1 min，再次水洗后加95%乙醇溶液，輕搖培養皿脫色20 s后再次水洗，最后用番紅染色2 min，沖洗后待干燥可進行鏡檢。

1.4.3莢膜染色選擇劃線培養的菌落用草酸銨結晶紫或石炭酸復紅染液進行初染5 min，水洗后待干燥再用墨汁襯染，干燥后進行鏡檢。

1.4.4淀粉水解選擇已培養的菌落，在培養皿上滴少量碘液，輕輕晃動培養皿使碘液均勻平鋪。若菌株周圍出現無色透明圈，說明淀粉已被水解，呈陽性。可以根據透明圈大小判斷水解淀粉的能力。

1.4.5油脂水解將菌株接種在油脂培養基中，在28 ℃恒溫條件下培養5 d。若培養基中出現紅色斑點，表明菌株能分解脂肪產生脂肪酸，呈陽性反應。

1.4.6吲哚試驗將菌種接種于試管裝的蛋白胨水溶液培養基中，37 ℃下培養4 d以上，在培養基中加入1～2 mL乙醚，輕搖，靜置3 min，再沿試管壁緩慢滴入3～5滴乙醚（此時不可搖動），觀察反應，若乙醚層呈現紅色則為陽性反應。

1.4.7過氧化氫酶測定取少量菌液涂抹于已滴有5% H2O2的培養皿上，如立即產生氣泡則為陽性，反之為陰性。

1.4.8葡萄糖產酸將葡萄糖蛋白胨水溶液裝入試管 115 ℃ 滅菌30 min，把試驗菌株接種于滅菌后的培養液中，在28 ℃恒溫狀態下培養5 d，加入5滴40%KOH后，再加入等量5%α-萘酚，振蕩后于37 ℃培養箱中靜置30 min后觀察。若試管中物體呈紅色，則其反應為陽性。

1.5固氮酶活性測定

固氮酶不但能將分子氮還原為氨，還可以催化一些具有N—N、NO、C≡N以及C≡C鍵化合物的還原，固氮酶可還原乙炔（C2H2）形成乙烯（C2H4），采用氣象色譜儀可快速測定固氮酶的乙炔還原活性。

將待測菌接種于50 mL三角瓶內的無氮培養基中，用封口膜密封在28 ℃恒溫條件下培養1 d，再用無菌膠塞密封瓶口。用無菌注射器抽出5 mL氣體，再注入等量乙炔氣體，繼續培養3 d，抽取1 mL氣樣，在氣相色譜儀中測定乙炔還原活性，以1 h、1 mL培養物產生的乙烯量表示固氮酶的活性。

乙炔還原活性=實際乙烯峰值×標準乙烯濃度×試管容積24.9×標準乙烯峰值×樣品培養時間。

式中：24.9為常數，乙炔還原活性即產生的乙烯濃度[nmol/（h·mL）]。

2結果與分析

2.1不同作物根際自生固氮菌數量分布

自生固氮菌適宜生長的溫度為28～30 ℃，在中性土壤中自生固氮菌會大量增殖。本研究采用平板計數法統計樣品自生固氮菌數量，結果見表1。適宜的稀釋度為10-4、10-5、10-6，本研究選取10-5 稀釋度進行計數。不同作物根際自生固氮菌數量不盡相同，油菜、玉米根際的自生固氮菌數量遠大于小麥、青稞。對菌種進行分離分別得到 19株自生固氮菌。

3結論

分離篩選了不同作物根際土壤自生固氮菌，對其形態特征和理化性質進行鑒定，并用乙炔還原法測定固氮能力。結果表明，在分離出的19株菌種中，油菜根際的自生固氮菌數量最多，且固氮酶活性較好，根據文獻[6]，結合菌株的形態學特征及部分生理生化反應特征，將從油菜根際分離的高效固氮菌株（油菜4）初步鑒定為德克斯氏菌屬（Derxia spp.）。本研究根據乙炔還原法篩選出各樣地固氮效果最好的菌株，為下一步的跟蹤研究及開發利用提供基礎。

自生固氮菌在土壤耕層分布較多，作物根際的自生固氮菌可通過固氮酶作用為作物提供氮素營養，對提高作物產量具有一定作用，同時這類菌種還可產生大量植物激素，從而影響植物生理過程以促進植物生長。本研究篩選的具有高效固氮能力的菌株可繼續進行盆栽試驗，以期為作物肥效試驗奠定基礎，并為微生物菌體研究提供依據。

參考文獻：

[1]陳今朝，向鄧云. 生物固氮的研究與應用[J]. 涪陵師專學報，2000，16（2）：93-96.

[2]葛誠. 微生物肥料概述[J]. 土壤肥料，1993（6）：43-46.

[3]陳文新，李阜棣，閆章才. 我國土壤微生物學和生物固氮研究的回顧與展望[J]. 世界科技研究與發展，2002，24（4）：6-12.

[4]李華，陳萬仁，王光龍. 生物固氮的研究與發展[J]. 鄭州工業大學學報，1997，18（3）：92-94.

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[6]東秀珠，蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京：科學出版社，2001：353-370.