復方中草藥肉雞飼料添加劑的抑菌及毒理學試驗

摘要：依據單味中草藥對肉雞規模化養殖常見病原菌的抑菌效果和飼喂效果，結合中醫藥理論，配制出3劑中草藥復方制劑，研究3劑中草藥復方制劑的體外抑菌效果和毒理試驗，以期為復方中草藥肉雞飼料添加劑的研制奠定安全性基礎。結果表明，配制的3劑中草藥復方制劑都有較好的抑菌和殺菌效果，并且是一種無毒副作用的純天然綠色藥物。綜合抑菌試驗和毒理學試驗結果，復方制劑Ⅲ效果最佳。

關鍵詞：中草藥；飼料添加劑；安全性；復方制劑配方

中圖分類號： S816.75 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0223-03

收稿日期：2013-09-26

作者簡介：楊猛（1980—），男，江蘇濱海人，碩士，講師，主要研究方向生物藥物。E-mail：spxyym80@163.com。隨著肉雞飼養方式從散養型向規模化轉變，其密度增加了1倍，密度的增加使發病率增加4倍以上。為保障肉雞的存活率，飼料添加劑的使用量逐漸增加，為肉雞養殖業的健康發展做出巨大貢獻的同時，也衍生出不少問題。飼料添加劑含有抗生素類藥物，可以提高肉雞的存活率和產量，但雞肉中藥物殘留的提高，直接危害了人類健康[1-3]。隨著人民生活水平的提高，人民的健康保健意識顯著增強，消費者對雞肉的品質和安全性等方面的要求越來越高，低脂藥殘少的雞肉成為消費者的首選。基于上述需求，開發一種既能提高肉雞存活率和產量，又能改善雞肉品質的飼料添加劑迫在眉睫，中草藥無毒副作用、無抗藥性、無污染、無殘留，且多為常見藥物，價格低廉，優于抗生素，因而成為人們研究開發的首選對象[4-8]。本研究在單味中草藥對肉雞養殖常見菌抑菌和飼喂研究的基礎上，依據中藥配伍的原理，配制3劑中草藥復方制劑，并對其進行抑菌試驗、毒理試驗，篩選出效果最好的中草藥復方制劑，進行飼喂試驗，旨在為研制應用于實際肉雞養殖業的復方中草藥肉雞飼料添加劑奠定理論基礎。

1材料與方法

1.1試驗試劑

根據單味中草藥的抑菌效果和病原菌種類，結合中醫藥理論，配制出3劑中草藥復方制劑，分別為制劑Ⅰ、制劑Ⅱ、制劑Ⅲ[9]，配方如下。

制劑Ⅰ：桂皮40%、小茴香30%、肉桂10%、陳皮10%、甘草10%，水煎取汁；制劑Ⅱ：黃芪40%、肉桂30%、貫眾10%、何首烏10%、甘草10%，水煎取汁；制劑Ⅲ：金銀花40%、黃芪30%、茯芩10%、陳皮10%、甘草10%，水煎取汁。

其他試劑有：瓊脂培養基、鮮血瓊脂培養基、無菌營養肉湯、抗雞紅細胞抗體、蒸餾水、無菌生理鹽水、小牛血清淋巴細胞分層液、0.8%戊二醛溶液、蘇木精和伊紅染色液。

1.2試驗動物

試驗動物為昆明種小白鼠。

1.3試驗儀器

試驗用儀器主要有：牛津杯、培養皿、TDL-40B低速臺式水平離心機、低溫冰箱、電熱恒溫水浴箱、OLYMPUS顯微鏡等。

1.4抑菌試驗方法

1.4.1藥敏性試驗采用牛津杯加注藥液的體外抑菌法。將12 cm滅菌培養皿分成6個扇區。將瓊脂培養基和鮮血瓊脂培養基倒平板，在每個平皿內均勻加入0.5 mL已制備的病原菌稀釋菌液。將牛津杯按順序放入6個扇區中央，杯內加入100 μL藥液，37 ℃培養24 h，觀察結果，并測量抑菌直徑。中草藥及復方的醇提物按同樣方法進行體外抑菌試驗[10]。

1.4.2最小抑菌濃度（MIC）和最小殺菌濃度（MBC） 的測定根據水提物、醇提物抑菌結果，采用10倍稀釋法及2倍稀釋法，測定MIC和MBC。（1）10倍稀釋法：用無菌營養肉湯倍比稀釋藥液（終體積5 mL），使藥液濃度分別為10-1、10-2、10-3、10-4等4個梯度（同時以無菌生理鹽水作空白對照，不接種菌液作陰性對照）；接種病原菌稀釋菌液20 μL，搖勻；37 ℃ 培養24 h。以不顯示濁度、細菌未生長時的藥物濃度作為MIC，并取該管中0.05 mL 肉湯，接種于營養瓊脂平板；37 ℃ 培養24 h，平板上無菌落或菌落生長數≤10的藥物濃度為MBC[10]。（2）2倍稀釋法：根據10倍稀釋法結果，進一步確定MIC和MBC。無菌營養肉湯倍比稀釋藥液，濃度梯度為1 ∶2、1 ∶4、1 ∶8、1 ∶16、1 ∶32、1 ∶64、1 ∶128、1 ∶256、1 ∶512；MIC和MBC判定同10倍稀釋法[10]。

1.5毒理學試驗方法

1.5.1急性毒性試驗（LD50的測定） 根據此前預試驗結果，設20 000、30 000、45 000、67 500 mg/kg 4個劑量組（等比級數1.5）和1個空白對照組。取18～22 g小白鼠，每組10只，雌雄各半，連續給藥7 d，每天觀察小白鼠精神、食欲、飲水、活動及中毒情況，并記錄小白鼠的死亡數目[11-12]。

1.5.2蓄積毒性試驗（20 d蓄積試驗法）取體重15～18 g的小白鼠，每組10只，雌雄各半，設4個劑量組和1個對照組，按1 000、2 000、4 000、8 000 mg/kg的劑量進行灌胃給藥，連續給藥20 d，在給藥期間觀察小白鼠的精神、食欲、飲水、死亡情況和有無異常反應。給藥停止后觀察7 d內小白鼠的死亡情況及體重的變化[11，13]。

1.5.3微核試驗取體重為18～22 g的成年小白鼠，每組10只，雌雄各半，設3個試驗組，1個陽性對照組和1個陰性對照組。試驗組按1%、2%、3%的劑量將中草藥飼料添加劑混入飼料中飼喂，陽性組用環磷酰胺100 mg/kg腹腔注射。試驗組和對照組均采用2次染毒法，間隔時間為24 h，于第2次染毒后6 h將各組小白鼠全部采用頸椎脫位處死法，取股骨制骨髓涂片，每個小白鼠計數1 000個PCE（polychromatic erythrocytes，嗜多染紅細胞），微核率以‰表示[11]。

1.5.4精子畸形試驗取體重20～25 g的雄性小白鼠，每組10只，設3個試驗組、1個陽性對照組和1個陰性對照組。試驗組按1%、2%、3%的劑量將中草藥飼料添加劑混入飼料中飼喂，每日染毒1次，連續5 d，陽性組用環磷酰胺50 mg/kg腹腔注射，每日1次，連續5 d。各組小白鼠于第35天處死，取附睪精子涂片，每只小白鼠計數1 000個完整精子，畸形率以‰表示[14-15]。

1.5.5數據統計分析試驗值以“平均數±標準差”表示，并采用SPSS 17.0進行單因素方差分析。

2結果與分析

2.1抑菌試驗結果

3結論

3劑中草藥復方制劑都有較好的抑菌和殺菌效果，并且復方制劑抑菌和殺菌效果均優于單味中草藥，綜合考慮對6種菌的抑菌和殺菌效果，制劑Ⅲ優于制劑Ⅰ、制劑Ⅱ。

急性毒理學試驗、蓄積毒性試驗、微核試驗和精子畸形試驗的試驗結果顯示，復方中草藥飼料添加劑是一種無毒副作用的純天然的綠色藥物。

參考文獻：

[1]尹緒貴. 當前養殖業中抗生素的應用情況[J]. 獸醫導刊，2013（2）：44-45.

[2]劉世剛，丁景華. 飼料中添加金霉素和喹乙醇使用現狀的分析[J]. 現代畜牧獸醫，2012（11）：41-42.

[3]林云. 飼料抗生素的應用及面臨的問題[J]. 飼料研究，2001（4）：25-26.

[4]李喆，鄭家明，張勇，等. 復合中草藥飼料添加劑改善蛋雞蛋品質的試驗研究[J]. 中國畜牧雜志，2011，47（16）：59-61.

[5]吳漢東. 中草藥添加劑對蛋雞生產性能及蛋品質的影響[J]. 飼料研究，2013（3）：80-82.

[6]王改琴，王恬. 中草藥飼料添加劑的功能及其在蛋雞生產中的應用[J]. 飼料博覽，2010（10）：37-39.

[7]彭玉麟，參木有. 中草藥飼料添加劑開發中存在的問題及對策[J]. 中國飼料，2001（8）：31-33.

[8]馬玉敏. 中草藥飼料添加劑研究綜述[J]. 乳業科學與技術，2001，24（1）：22-24.

[9]黃亞東，孔慶新，王仁雷，等. 復方中草藥治療奶牛隱性乳腺炎試驗[J]. 中國乳品工業，2007，35（8）：39-41.

[10]黃亞東，王仁雷，孔慶新，等. 奶牛乳腺炎病原菌的中草藥體外抑菌試驗[J]. 中國乳品工業，2005，33（11）：27-29.

[11]楊 猛，王仁雷，黃亞東. 中草藥飼料添加劑對小白鼠的毒理作用[J]. 江蘇農業科學，2010（2）：227-228.

[12]關立增，鞠玉琳. “壯陽促孕散”的急性毒性與蓄積毒性試驗研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫，2005（2）：68-68.

[13]潘玉善，苑麗，胡功政，等. 肉雞大腸桿菌產超廣譜β-內酰胺酶的檢測與藥敏分析[J]. 江蘇農業科學，2010（2）：225-227.

[14]黃亞東，楊猛，王仁雷. 中草藥飼料添加劑對小白鼠的特殊致變作用的影響[J]. 中國乳品工業，2009，37（12）：19-20.

[15]沈建忠. 動物毒理學[M]. 北京：中國農業出版社，2002：227-234.