RP—HPLC法測定湘西藤茶二氫楊梅素的含量

摘要：采用索氏提取法、乙醇浸提法、超聲波-乙醇法提取藤茶中二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY），RP-HPLC法測定其含量。結果表明，超聲波-乙醇法提取率最高，采用Sino chrome C18柱，以甲醇-0.1%磷酸（體積比27 ∶73）為流動相，檢測波長為294 nm時，線性關系良好（r=0.999 2），平均加樣回收率為97.8%，RSD=0.69%；重現性試驗RSD為0.33%，說明該方法準確、可信度高。湘西藤茶DMY含量在5月底達到最高，葉中約25.43%，莖中約6.22%，因此其最佳采摘時期為5月底。

關鍵詞：藤茶；最佳采摘期；超聲波-乙醇法；二氫楊梅素（DMY）；RP-HPLC

中圖分類號： R284.1；O657.7+2 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0332-03

收稿日期：2013-09-15

基金項目：湖南省科技計劃（編號：2013FJ6090）；湖南省高校科技創新團隊支持計劃（編號：2010212）；湖南省“十二五”植物學重點建設學科項目（編號：201142）。

作者簡介：付明（1966—），女，湖北荊門人，副教授，主要從事植物生物化學研究。E-mail：fm6988@163.com。藤茶別稱顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata），屬葡萄科蛇葡萄屬。湘西少數民族將其制成保健茶，長年飲用可強身健體，還可治療感冒、咽喉腫痛、黃疸型肝炎等癥[1]。藤茶有抗氧化作用[2-3]，含有大量黃酮類物質，其中主要是二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）。有研究表明，藤茶葉中總黃酮含量達45%[4-5]，DMY含量達16.32%～33.03%[6]，這是非常罕見的，吸引了許多學者開展相關研究。黃酮物質可抑制脂質過氧化[7]、抑菌[8]、降血壓、降血糖[9-10]、減輕肝細胞變性和腫脹[11]、增強單核巨噬細胞吞噬功能和溶血功能、抗腫瘤、祛痰止咳等。隨著研究的深入，DMY降血糖、抗氧化、抑菌、抗腫瘤等活性成為研究熱點。本研究以湘西藤茶為原料，從索氏提取法、乙醇浸提法、超聲波-乙醇法中選擇DMY提取率最高的方法提取樣品DMY，再用反相高效液相色譜（RP-HPLC）法對不同時期、不同部位DMY含量進行測定，確定湘西藤茶的最佳采摘時期，為其合理開發提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料與儀器

藤茶采自湖南省懷化市。DMY對照品（純度99%，湖南省張家界至誠生物有限公司）；甲醇、磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司），均為色譜純。

Waters 1525高效液相色譜儀（美國Waters公司）；JY98-IIDN 智能型超聲波細胞粉碎機（浙江省寧波新芝生物科技股份有限公司）；FW177型中草藥粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2方法

1.2.1樣品溶液的制備將材料洗凈、切段、干燥后粉碎并過60目篩，密封保存。

索氏提取法：取樣品2.0 g置于索氏提取器中，回流提取8 h，收集濾液，旋轉蒸發濃縮后用65%乙醇定容至100 mL。取150 μL稀釋后用0.45 μm濾膜過濾制成相當于原料 0.3 mg/mL 的樣品液1。

乙醇浸提法：取樣品2.0 g置于三角瓶中，加入65%乙醇，65 ℃下振蕩提取24 h，5 000 r/min離心，收集濾液，用65%乙醇定容至100 mL。同上處理得樣品液2。

超聲波-乙醇提取法：取樣品2.0 g加入40 mL 65%乙醇，于65 ℃溫水中浸提2 h；用超聲波處理20 min，離心；濾渣再用40 mL 65%乙醇超聲25 min，離心；合并濾液，用65%乙醇定容至100 mL。同上處理得樣品液3。

1.2.2色譜條件的選擇選擇色譜柱系Sino chrom C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速1.0 mL/min；進樣體積 20 μL；柱溫31 ℃；流動相為甲醇-水，分別用磷酸、磷酸二氫鈉調節pH值，以不同的比例分別在294、310 nm波長處進樣，根據峰形確定最佳的色譜條件。

1.2.3標準曲線及線性關系考察取干燥后的DMY粉末0.010 6 g，用甲醇溶解、定容至10 mL，配成1.06 mg/mL的DMY對照品液。分別取DMY對照品溶液0.1、0.4、0.7、1.0、1.3、1.6、1.9 mL于25 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成不同濃度的對照品溶液。吸取各濃度對照品溶液20 μL，注入色譜儀，按確定的色譜條件測峰面積，以峰面積對DMY濃度繪制標準曲線。

2結果與分析

2.1色譜條件的確定

當采用甲醇-水為流動相時，出現拖尾；加入磷酸二氫鈉時，拖尾現象稍有改善但分離效果不太好；加入磷酸時，消除了拖尾現象，峰形對稱，分離效果好。將甲醇-0.1%磷酸按（20～80） ∶（20～80）進樣，當甲醇、0.1%磷酸體積比27 ∶73時，對照品和樣品的各組分達到了良好的分離，且保留時間適中。當檢測波長為294 nm時，DMY的峰無雜質干擾。因此，確定最佳色譜條件為Sino chrom C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），柱溫31 ℃，檢測波長294 nm；流動相為甲醇-0.1%磷酸（27 ∶73），流速1.0 mL/min；進樣體積 20 μL。按照該色譜條件將對照品和樣品液分別進樣，RP-HPLC 圖譜分別見圖1、圖2，DMY保留時間約為 7.5 min。

2.2標準曲線及回歸方程的建立

以峰面積對對照品濃度繪制標準曲線，得回歸方程y=60 055.848 5x-73 641.974 2，r=0.999 2，說明在4.24～8056 g/mL范圍內峰面積與濃度呈良好的線性關系。

2.3二氫楊梅素提取方法的確定

將樣品液1、樣品液2、樣品液3分別在確定的色譜條件下進樣，平均峰面積分別為2 631 664、2 975 265、3 087 388 μV·s，樣品液3的峰面積最大，說明超聲波-乙醇法的提取效率最高，故采用超聲波-乙醇法提取藤茶DMY。

2.4精密度和穩定性試驗

取同一份對照品溶液重復進樣5次，記錄DMY的峰面積（表1），計算RSD為1.6%。

2.6樣品中二氫楊梅素含量的測定

藤茶莖、葉中DMY含量在5月底達到最高，葉中含量約25.43%，莖中約6.22%，之后DMY含量逐漸降低。4—9月的藤茶莖、葉的DMY含量如圖3所示。

測定DMY含量的方法有分光光度法、比值-導數熒光法、HPLC法等。何桂霞等用乙醇回流法提取顯齒蛇葡萄中DMY，用Novapak-C18 柱于25 ℃、290 nm檢測，葉中DMY含量最高達31.25%，莖中最高達9.2%[12]。范世明等以乙腈-0.1%磷酸（8 ∶92）為流動相，用HPLC法測得閩產顯齒蛇葡萄葉中DMY含量為33.03%，莖中為4.49%[6]。結果的差異可能是由材料來源、提取方法、采用的柱、流動相、柱溫等不同造成的，也說明該植物在不同地區因地理、氣候、海拔等因素不同，DMY含量在不同季節有很大區別。本試驗選擇甲醇作流動相，是因為甲醇經濟實惠，并且毒性較乙腈?。恢噩F性試驗的RSD為0.33%，表明結果可信度高。

3結論

本研究比較了3種提取方法，結果表明超聲波-乙醇法提取樣品DMY的時間最短、提取率最高，該法可以作為提取黃酮、DMY的通用方法。

RP-HPLC法具有快速省時、簡便，方法靈敏、精密度高等特點，適合于藤茶DMY含量的測定。本研究測得湘西藤茶不同時期葉中DMY含量為11.21%～25.43%，莖中為30%～6.22%；在5月底采摘湘西藤茶，可使藤茶得到充分利用，保健價值高。

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