枳椇多糖體外抗氧化活性研究

摘要：以維生素C作為陽性對照，采用羥自由基體系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基體系（DPPH·）和超氧陰離子自由基體系（ O-2· ），對枳椇多糖的體外抗氧化活性進行研究。試驗結果顯示：枳椇粗多糖和精制多糖都具有一定的抗氧化活性，在一定濃度范圍內，其抗氧化活性與濃度呈線性關系。總體上說，當濃度達到2.50 mg/mL時，枳椇粗多糖對羥自由基的清除率高達68.32%，精制多糖對羥自由基的清除率高達81.43%；當濃度達到1.00 mg/mL時，枳椇粗多糖和精制多糖對DPPH自由基清除率都較高，可達80%左右，與維生素C接近；對超氧陰離子自由基的清除能力較前兩者小，當濃度達到1.00 mg/mL時，枳椇粗多糖的清除率為48.24%，精制多糖的清除率為14.79%。

關鍵詞：枳椇；多糖；抗氧化

中圖分類號： R284.1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）07-0316-03

收稿日期：2014-05-20

基金項目：四川理工學院大學生創新基金（編號：cx20120407）。

作者簡介：魏丕偉（1983—），男，博士，講師，主要從事生物技術方面的研究。Tel：（0813）5505979；E-mail：weipiwei2004@163.com。

通信作者：王凌云。E-mail： wanglingyun2004@163.com。枳椇（Hovenia acerba Lindl.）俗稱拐棗，是一種遍布我國除東北、新疆、西藏以外大部分省區的鼠李科落葉喬木。枳椇果柄中含有豐富的多糖類化合物，其活性還未見報道。隨著番茄紅素抗氧化性的報道，番茄紅素的保健品備受青睞，具有抗氧化活性的天然化合物的研究成為熱潮。抗氧化性的評價有化學方法和生物學方法。化學方法可通過自由基的清除來表示，簡單便捷，準確率高。自由基是生物體氧化過程中產生的中間代謝產物，當其過多時，會作用于生物膜磷脂不飽和脂肪酸、膜蛋白、代謝酶，影響細胞代謝的有序性和自調節能力，甚至使DNA分子變得不穩定，造成DNA損傷從而引起基因突變等[1]。盡管活的有機體一定程度上具有清除自由基的能力，但是適當補充外源性抗氧化劑仍然是有必要的。事實上，超氧陰離子自由基（ O-2· ）、二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）和羥自由基（OH·）等與衰老、癌癥、心腦血管疾病和炎癥的發生與發展密切相關。某些人工合成的抗氧化劑如BHT、BHA及PG等有一定的毒性，會對人體呼吸酶的活性造成不利的影響，甚至還有不同程度的致畸、致癌效應，這也引起了人們對人工化學合成抗氧化劑的擔憂[2]。鑒于此，天然抗氧化劑的開發和使用，正成為現代食品工業發展所關注的焦點之一，具有廣闊的應用前景。本試驗對枳椇多糖的抗氧化活性進行測定，以期為枳椇的深入開發利用提供參考。

1材料與方法

1.1試驗原料

枳椇購自安國藥材市場，產地湖北。去除種子，取其果梗，蒸餾水清洗，置于烘箱55 ℃烘干，粉碎，過60目篩，粉末備用。

1.2試劑

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·），Sigma公司；鄰二氮菲，上海中秦化學試劑有限公司；維生素C，天津市恒興化學試劑制造有限公司；Tris（別名三羥甲基氨基甲烷、緩血酸胺），成都化學試劑廠；透析袋，成都奧克生物技術有限公司；甲醇、無水乙醇、鹽酸、鄰苯三酚、氯仿、正丁醇、過氧化氫、七水合硫酸亞鐵、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖、蒽酮等均為國產分析純。

1.3主要儀器設備

UV1000紫外可見分光光度計，上海天美科學儀器有限公司；Alpha1-2 LD plus冷凍干燥機，德國CHRIST；JD100-4G電子天平，沈陽龍騰電子有限公司； RE-52A旋轉蒸發器，上海紅葉儀器設備公司；SHB-III循環水式真空泵，鞏義市宇翔儀器有限公司；TDL-5C低速臺式大容量離心機，上海安亭科學儀器廠；粉碎機、電熱鼓風干燥箱、恒溫水浴鍋等。

1.4試驗方法

1.4.1枳椇粗多糖及精制多糖的制備由四川理工學院食品質量與安全實驗室制備，方法參照文獻[3]。

1.4.2枳椇多糖對羥自由基的清除試驗枳椇多糖對羥自由基的清除是通過Fenton反應模型實現的，Fe2+與 鄰二氮菲在 pH值2～9 的范圍內可形成穩定的橙紅色絡合物，其最大吸收波長為510 nm[4]。Fenton體系中產生的羥自由基，可使Fe2+氧化為Fe3+，從而使在510 nm處的最大吸收峰消失，據此可推知系統中羥自由基的量的變化。當加入抗氧化劑時，枳椇多糖能清除溶液中游離的·OH，因而可以通過測量吸光度間接計算出樣品對·OH 的清除率。精確稱取一定量的枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和維生素C，均配制成0.50、1.00、150、2.00、2.50 mg/mL等5個濃度的待測液。試驗分成5個平行組：調空白、空白組、對照組、樣品組、本底組。取 0.75 mmol/L 鄰二氮菲溶液1.0 mL于試管中，加入 0.2 mol/L 磷酸鹽緩沖液（PBS，pH值7.4）2.0 mL和蒸餾水10 mL，充分混勻后，依次加入1.0 mL新配制的0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，混勻，加入1.0 mL新配制的0.01%雙氧水（H2O2），37 ℃下溫浴60 min后，在510 nm處測吸光度，所測得的數據為損傷管的吸光度D損傷；未損傷管以1.0 mL蒸餾水代替損傷管中1.0 mL 0.01%雙氧水（H2O2），操作方法同損傷管，可測得510 nm未損傷管的吸光度D未損；樣品管以1.0 mL樣品代替損傷管中的1.0 mL 蒸餾水，操作方法同損傷管，可測得510 nm樣品管的吸光度D樣 ；將樣品組中除樣品不變，其余以對應體積蒸餾水代替，可測得510 nm樣品管的吸光度D本底（詳細加樣量如表1）。記錄數據，分別計算枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和維生素C對羥自由基的清除率。清除率（P）的計算公式為：P=（D樣-D本底-D損傷）/（D未損-D損傷）×100%。式中的吸光度D詳見表1。

2結果與分析

2.1枳椇多糖對羥自由基的清除作用

羥自由基毒性強、危害大，往往很難消除[7]。它的清除率是反映樣品抗氧化活性的重要指標。枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和維生素C 3種樣品溶液清除羥自由基的效果如圖1所示。由圖1可以看出，在試驗濃度范圍0.50～2.50 mg/mL，清除率與樣品濃度有良好的線性關系。三者清除羥自由基的能力大小是維生素C>枳椇精制多糖>枳椇粗多糖。在濃度為0.50 mg/mL時，枳椇粗多糖對羥自由基的清除率為1089%，枳椇精制多糖對羥自由基的清除率為38.44%；隨著樣品濃度逐漸增大，枳椇粗多糖、枳椇精制多糖、維生素C清除羥自由基的能力都是逐漸增大，當濃度達到2.50 mg/mL時，枳椇粗多糖對羥自由基的清除率高達68.32%，枳椇精制多糖對羥自由基的清除率高達81.43%。可見枳椇多糖有明顯的清除羥自由基的作用。

2.2枳椇多糖對DPPH自由基清除作用

二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）是一種很穩定的以氮為中心的自由基，其結構中含有3個苯環，1個氮原子上有1個孤對電子，在517 nm有強吸收，其甲醇溶液呈紫色，當在其甲醇溶液中加入自由基清除劑時，DPPH·的單電子被配對，溶液的顏色會變淺，517 nm處的吸光度變小，而且顏色變淺的程度可以反映清除效果的大小[8]。枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和維生素C 3種樣品溶液清除DPPH自由基的效果比較見圖2。由圖2可以看出，在試驗濃度范圍0.20～1.00 mg/mL，隨著樣品濃度逐漸增大，枳椇粗多糖和維生素C對DPPH自由基的清除率逐漸升高，而枳椇精制多糖對DPPH自由基的清除率變化不大，略有升高。當濃度為 0.20 mg/mL 時，枳椇粗多糖的清除率為43.58%，枳椇精制多糖的清除率達到67.57%，甚至高于維生素C的清除率（6081%），這說明在較小濃度范圍內枳椇多糖就具有清除DPPH自由基的能力。當濃度為1.00 mg/mL時枳椇粗多糖、枳椇精制多糖與維生素C的清除能力相當，達到了80%左右。

2.3枳椇多糖對超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子性質活潑，具有很強的氧化性和還原性，過量生成可致組織損傷，在體內主要通過超氧歧化酶清除[9]。本試驗以鄰苯三酚自氧化反應產生超氧陰離子自由基為模型。鄰苯三酚在堿性條件下自氧化產生超氧陰離子自由基，超氧陰離子在體系中不斷增加，生成有顏色的中間代謝產物，加入清除劑，可清除超氧陰離子自由基，阻止產物積累，使325 nm下的吸光度變小。故將枳椇多糖樣品溶液及陽性對照物維生素C作為抑制劑加入到超氧陰離子自由基發生體系中，測定其吸光度的變化來判斷樣品對超氧陰離子自由基的清除效果。

枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和維生素C 3種樣品溶液對超氧陰離子自由基的清除效果比較見圖3。由圖3可以看出，在試驗濃度范圍0.20～1.00 mg/mL，隨著樣品濃度逐漸增大，維生素C的清除率穩定，均高于90%，枳椇粗多糖的清除率略有上升，維持在30%～50%之間，枳椇精制多糖的清除率隨濃度上升，但均低于15%。當濃度達到1.00 mg/mL時，枳椇粗多糖的清除率為48.24%，枳椇精制多糖的清除率僅為14.79%。可見在對超氧陰離子自由基清除效果方面，枳椇粗多糖要優于枳椇精制多糖，而維生素C又明顯高于二者，說明枳椇多糖對超氧陰離子自由基有一定的清除作用。

3結論

本試驗通過羥自由基體系（·OH）、二苯代苦味酰基自由基體系（DPPH·）和超氧陰離子自由基體系（ O-2· ），對枳椇多糖的體外抗氧化活性進行研究，以維生素C作為陽性對照，比較枳椇粗多糖、枳椇精制多糖對3種自由基的清除效果。研究表明，對Fenton體系產生的羥自由基，枳椇精制多糖有較好清除作用，清除能力大小為：維生素C>枳椇精制多糖>枳椇粗多糖。在濃度為0.50 mg/mL時，枳椇粗多糖對羥自由基的清除率為10.89%，枳椇精制多糖對羥自由基的清除率為38.44%；當濃度達到2.50 mg/mL時，枳椇粗多糖對羥自由基的清除率高達68.32%，枳椇精制多糖對羥自由基的清除率高達81.43%。在DPPH自由基體系中，枳椇多糖在較低濃度就表現出對DPPH自由基很高的清除能力，在濃度為1.00 mg/mL時枳椇粗多糖、枳椇精制多糖和維生素C的清除能力接近，高達80%左右。枳椇多糖對超氧陰離子有一定清除作用，但清除效果不明顯，枳椇粗多糖的清除率在30%～50%之間，枳椇精制多糖的清除率隨濃度略有上升，但低于15%；清除作用大小為：維生素C>枳椇粗多糖>枳椇精制多糖。枳椇粗多糖與枳椇精制多糖比較，對羥自由基體系、DPPH自由基的清除效果，是枳椇精制多糖優于枳椇粗多糖，但對超氧陰離子自由基的清除效果是枳椇粗多糖優于枳椇精制多糖，可能是枳椇粗多糖中未除凈的色素等雜質也起到了一定的清除超氧陰離子自由基的作用，使得枳椇粗多糖的清除率大于枳椇精制多糖。可見，并不是樣品的純度越高，清除自由基的效果越好。總之，枳椇粗多糖、枳椇精制多糖對羥自由基、DPPH自由基和超氧陰離子自由基都有不同程度的清除作用，可以開發成枳椇多糖抗氧化作用的功能性食品。

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