同型半胱氨酸對血管平滑肌細胞中PTEN甲基化的影響

摘要：目的 探討同型半胱氨酸（homocysteine， Hcy）磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因 （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， PTEN）啟動子區DNA甲基化的影響。方法 原代培養血管平滑肌細胞（VSMCs），100 M Hcy刺激48h后，以實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）檢測PTEN mRNA 表達水平的變化，western blot檢測PTEN蛋白表達變化；生物信息學分析PTEN啟動子區CpG島，巢式降落時甲基化特異性PCR（nMS-PCR）檢測PTEN DNA甲基化水平。結果 與正常對照組相比（0 M Hcy），給予100 M Hcy刺激后，VSMCs中PTEN mRNA 及蛋白表達水平均降低；其啟動子區存在數個CpG島，其DNA甲基化水平升高。結論 Hcy可下調VSMCs中PTEN的表達，而PTEN DNA啟動子區的高甲基化可能在這一過程中起到關鍵調控作用。

關鍵詞：同型半胱氨酸；PTEN；DNA甲基化；血管平滑肌細胞；動脈粥樣硬化

血管平滑肌細胞（Vascular smooth muscle cells， VSMCs）的活化、增殖等改變是動脈粥樣硬化（Atherosclerosis， AS）形成的中心環節。同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）是AS的獨立危險因子[1]，可以促進VSMCs的增殖[2]。磷酸酶與張力蛋白同源缺失性基因 （phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten， PTEN） 在細胞的生長、存活、遷移、分化等過程中發揮了重要作用。但Hcy是否通過影響PTEN DNA甲基化影響其在血管平滑肌細胞的表達目前未見報道。本研究用Hcy干預VSMCs，檢測PTEN mRNA、蛋白表達其啟動子區 DNA甲基化水平，為今后研究Hcy導致AS的發生發展機制打下基礎。

1資料與方法

1.1一般資料 原代人臍靜脈平滑肌細胞由本實驗室培養；DMEM培養基、胎牛血清、胰酶購自Hyclone公司；逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自Fermentas公司；TRIzol試劑購自Invitrogen公司；DNA抽提試劑盒購自北京百泰克；DNA甲基化修飾試劑盒購自美國ZYMO RESEARCH；兔抗人PTEN抗體、兔抗β-actin、辣根酶標記羊抗兔IgG 購自北京博奧森生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1原代細胞人臍靜脈平滑肌細胞培養與鑒定 采用于海嬌[2]等方法培養及鑒定原代培養的人臍靜脈平滑肌細胞。……