脫細胞同種異體神經移植物組織相容性初探

摘要：目的探討脫細胞大鼠坐骨神經的組織相容性。方法應用低滲脫細胞方法制備脫細胞同種異體神經移植物-脫細胞大鼠坐骨神經(Acellular Rat Sciatic Nerve，ARSN)，進行組織學觀察和免疫組織化學方法檢測，肌肉埋植術后分別于第4d和第7d進行其組織相容性分析。結果①ARSN保存了雪旺細胞基底膜管以及神經外膜和束膜的細胞外基質結構，清除了軸突、髓鞘及雪旺細胞神經外膜和束膜的細胞結構。②肌肉埋植后第4d，ARSN神經外膜結構吸收明顯，周圍出現由新生肉芽組織構成的環狀包繞；第7d，ARSN神經外膜結構已被吸收，周圍肉芽組織趨于成熟，無淋巴細胞。③免疫組織化學法檢測FN和LN可見ARSN基底膜管壁分別呈棕黃色和黃色，但較NRSN陽性略弱。結論采用低滲脫細胞方法制備的周圍神經細胞外基質支架保留了對神經再生具有促進作用-FN和LN，具有良好的組織相容性，可隨著時間的推移逐漸降解。

關鍵詞：神經組織工程；脫細胞神經異體移植物；神經再生；大鼠

Acellular Allogenic Nerve Graft Tissue Biocompatibility Study

SUN Hui-zhe1，ZENG Liang1，TIAN Wei1，WANG Xiao-jie1，TONG Xiao-jie2

(1.Department of Human Anatomy，Shenyang Medical College，Shenyang 110034，Liaoning，China;2.Department of Human Anatomy，China Medical University，Shenyang 110001，Liaoning，China)

Abstract：ObjectiveTo explore histocompatibility of acellular rat sciatic nerve.MethodsPrepared acellular rat sciatic nerve(ARSN) with hypotonic acellular treatment. Histological observation and examined by immunohischemical method. Ananlyzed histocompatibility after implantation in muscle respectively.Results①ARSN reserved basement membrane tube of SC(Schwann cells) and ECM(extracellular matrix) of epineurium and perineurium， while axis-cylinder， myelin sheath and cell structure of epineurium and perineurium were cleared away. ②Histological observation of ARSN after implantation in muscle. After HE staining showed: on the 4th day， epineurium left in ARSN group was absorbed obviously. Also， a ring structure formed of new-born granulation tissue surrounded ARSN. On 7th day of implantation， epineurium left in ARSN was absorbed completely and granulation tissue tended to be mature. And we saw no lymphocyte. ③Examination of laminin(LN) and fibronectin(FN) by immunohistochemical method， We could see that basement membrane was yellow or brown showing positive reaction. ConclusionThe cytoskeletal of acllular peripheral ECM we prepared reserved important components of ECM of nerve tissue which might promote nerve regeneration， LN and FN. They had good histocompatibility and would be degraded with time flies.

Key words：Nerve tissue-engineering; Acellular peripheral nerve allograft;Nerve regeneration;Rat

周圍神經缺損的修復、再生和功能重建目前仍然是創傷外科的難題之一。近年來，隨著周圍神經組織工程的日漸發展，由雪旺細胞(Schwann cell， SC)為核心，具有良好促進周圍神經再生的生物可降解材料為支架，能支持SC存活和再生的細胞外基質(extracellular matrix， ECM)為復合劑，SC、生物材料和生物基質三個核心要素的有機結合構成了周圍神經組織工程的基礎[1]。ECM是去除細胞后的所有組織成分，是細胞附著的基本框架，具有連接和支持細胞的作用，也是細胞的代謝場所，其形態和功能直接影響所構成組織形態和功能[2]。目前，天然的ECM已成功用于研制人工皮膚[3]，并對血管、骨、軟骨、心包、膀胱等做了大量研究，為應用天然ECM設計人工神經替代物提供了理論基礎和新的研究思路。

本研究成功制備脫細胞同種異體神經移植物-脫細胞大鼠坐骨神經(Acellular Rat Sciatic Nerve， ARSN)，并采用肌肉埋植的方法觀察其組織相容性，為臨床篩選組織相容性良好的周圍神經ECM做為移植支架提供依據。

1資料與方法

1.1實驗動物和試劑Wistar大鼠（體重180～200g），分為實驗組35只，正常對照組35只。

TritonX-100，PepstatinA（Sigma公司），牛胰脫氧核糖核酸酶（DNase）、牛胰核糖核酸酶（RNase）（華美生物工程公司），三羥甲基胺基甲烷（Tris，美國Gibco公司），Aprotinin，Leupeptin， Fibronectin（FN）、Laminin（LN）抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.2 ARSN的制備采用組織工程化低滲脫細胞方法。取Wista大鼠雙側坐骨神經，Tris-HCl緩沖液中浸泡，利用低滲作用脹破雪旺細胞、神經外膜及束膜等的細胞；使用TritonX-100、蛋白酶抑制劑(0.1μg/ml aprotinin，0.5μg/ml leupeptin，0.6μg/ml pepstatinA)、DNase、RNase等藥品，按照一定的步驟和時間，在適當的溫度、pH下，對坐骨神經進行脫細胞處理；

1.3組織學觀察ARSN與NRSN用10％福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡觀察。取兩例ARSN用4％多聚甲醛和0.5％戊二醛混合固定液固定，鋨酸后固定，制成掃描電鏡樣本，電鏡觀察。

1.4免疫組織化學法（鏈霉菌抗生物素蛋白－過氧化物酶連結法）檢測LN和FNⅠ抗為兔抗鼠Fibronectin和Laminin抗體。PBS沖洗ARSN和NRSN，滴加3%的H2O2-甲醇15min。PBS 沖洗，滴加第一抗體，4℃過夜。第2d用PBS沖洗，加入第二抗體（生物素化羊抗鼠IgG），室溫下1h。PBS沖洗2次，室溫下加鏈霉素抗生素蛋白-過氧化物酶溶液1h。DAB染色，蘇木素復染，脫水、透明、封片，光鏡觀察。

1.5 ARSN的肌肉埋植分別取ARSN和NRSN埋植于大鼠股四頭肌內。術后分別于第4、7d取出埋植物，周圍帶少量肌肉組織。10％的福爾馬林固定，常規石蠟包埋，橫切片，HE染色，光鏡觀察。

2結果

2.1 ARSN與NRSN的組織結構差異HE染色光鏡觀察ARSN，可見橫切面呈網狀，髓鞘、軸突均已經消失，僅見雪旺細胞基底膜，未見雪旺細胞核，神經外膜、束膜內未見細胞結構（圖1、2）；縱切面可見基底膜呈典型的長空管狀，雪旺細胞核、軸突和髓鞘均已消失，神經外膜、束膜中也未見細胞結構（圖3、4）。掃描電鏡觀察，ARSN的軸突和髓鞘已經消失，僅可見空虛的基底膜管，與NRSN有明顯的差異（圖5，6）。

2.2免疫組織化學法檢測LN和FN采用免疫組織化學法檢測ARSN內的FN和LN，光鏡觀察可見基底膜管壁呈棕黃色、黃色的FN和LN陽性反應，說明脫細胞處理后，FN和LN的成分仍保留于基底膜管上，但與NRSN比較，陽性較弱，說明有少部分細胞外基質成分在脫細胞的過程中也被脫掉（圖8-10）。

2.3 ARSN肌肉埋植后的組織學觀察ARSN埋植大鼠股四頭肌后取材，經HE染色，組織學觀察：埋植第4d，ARSN組周圍有炎性細胞浸潤，并有大量新生的毛細血管、成纖維細胞（圖13），剩余的神經外膜結構吸收明顯（圖11），新生肉芽組織環形包繞在ARSN的周圍（圖11）；NRSN組周圍有炎性細胞浸潤，有新生的毛細血管、成纖維細胞（圖14），但神經外膜結構完整（圖12）。

埋植第7d，ARSN周圍的肉芽組織趨于成熟，新生毛細血管減少，成纖維細胞增多，剩余的神經外膜結構已被吸收（圖15），未見淋巴細胞（圖17）；NRSN周圍的成纖維細胞增多，肉芽組織趨于成熟（圖18），神經外膜結構仍保持完整（圖16）。

3討論

周圍神經損傷，尤其是長段缺損的修復一直是神經外科學關注的前沿課題之一。較早采用的幾丁質管、硅膠管、Dacron管等其生物相容性差；而近年來，PLA、PGA、PLGA等的研究，雖較傳統管材有了進步，但缺乏神經再生的微環境條件，還有排斥反應和繼發感染的可能；其他研究中采用過的膠原、FN、LN等細胞外基質成分均缺乏真正意義的仿生性。

同種異體移植的主要問題是免疫排斥反應，而核心問題是組織相容性復合體（MHC），其表達產物主要位于細胞膜表面，構成多種細胞的膜抗原，是產生移植免疫的主要原因[7]。研究表明，含有FN、LN及Ⅳ型膠原蛋白等大分子物質的細胞外基質幾乎沒有免疫原性。

采用低滲脫細胞方法制備同種異體神經移植物，僅保留了雪旺細胞基底膜管的結構，脫去了雪旺細胞、軸突和髓鞘，此過程被形象的稱為\"化學抽吸\"[4]。經過這種方法處理的移植物已失去明顯的抗原性，能夠有效的促進受體的雪旺細胞和軸突再生，且不會發生明顯的排異反應。與反復冰凍融解等物理辦法制備的移植物相比較，其滲透性明顯優于后者[5]。經脫細胞處理后，FN和LN仍保留基底膜上。天然的神經細胞外基質具有促進軸突再生的作用[2]，與其所含的主要成分如FN、LN、硫酸肝素蛋白多糖(HSPG)及Ⅳ型膠原蛋白等的生物學功能有關。其中LN的研究較多，認為其是由A鏈和B1鏈與B2鏈共同構成的十字架形結構的多機能蛋白，不僅對神經再生有明顯的引導和促進作用，還可以為神經再生提供良好的微環境條件[6]。

本研究采用低滲脫細胞的組織工程學的方法，制備出具有仿生性的三維立體結構的天然神經移植物，是一種天然的生物衍生材料，雖然優化制備過程、植入后抗原性和組織相容性的進一步檢測、ARSN與種子細胞三維聯合培養技術和裝置的研究等問題仍有待進一步的深入摸索，但其可以作為周圍神經組織填充物而長期存在、具有較好的組織相容性和親和性的優點，使其具有廣泛的臨床應用前景。

參考文獻:

[1]王光林，楊志明，解慧琪，等.周圍神經組織工程材料的預構[J].中國修復與重建外科雜志，2000， 14(2):110-114.

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[6]Tong XJ， Hirai K， Shimada H， et al. Sciatic nerve regeneration navigated by laminin-fibronectin double coated biodegradable collagen grafts in rats. Brain Res， 1994， 663(1):155-162.

[7]Trumble TE， Shon FG.. The physiology of nerve transplantation[J].Hand Clin， 2000， 16(1): 105-122.

編輯/申磊