吲哚美辛抑制大鼠子宮內膜異位癥微血管形成的實驗研究

摘要：目的研究吲哚美辛對大鼠子宮內膜異位癥微血管的影響。方法建立大鼠子宮內膜異位癥模型。隨機分組：治療組喂服吲哚美辛(5mg·kg-1·d-1)，對照組給予相應體積溶劑(0.2%二甲亞砜-生理鹽水溶液)。4w后處死動物，采用免疫組化法檢測子宮內膜組織中微血管密度(MVD)及血管內皮生長因子(VEGF)的表達，兔抗大鼠CD34標記微血管。結果子宮內膜體積治療組和對照組MVD分別為15±3和27±5(P<0.05)，VEGF的表達強度分別為1.4±0.8和3.5±1.1(P<0.05)，實驗結束時未見明顯毒性反應。結論吲哚美辛能通過抑制子宮內膜微血管形成治療子宮內膜異位癥，其機制可能與抑制VEGF的表達有關。

關鍵詞：吲哚美辛；子宮內膜；血管生成；微血管密度；血管內皮生長因子

持續的血管生成是子宮內膜異位癥的發生發展的一個關鍵因素，新生血管為子宮內膜細胞提供增殖所必需的營養物質、氧氣及各種生長因子。據此，Shifren在1996年首次提出抑制子宮內膜的血管形成可作為治療子宮內膜異位癥的一種手段[1]。吲哚美辛是一種非甾體抗炎藥，近年來大量研究資料表明，吲哚美辛可有效降低血管內皮生長因子(VEGF)表達，減少微血管密度(MVD)[2，3]。本實驗以大鼠子宮內膜異位癥模型為研究對象，觀察吲哚美辛對子宮內膜及其新生血管的影響。

1資料與方法

1.1一般資料吲哚美辛（美國Sigma公司）、二甲基亞砜(DMSO)（美國MPBIO公司）。吲哚美辛溶于DMSO中，應用前臨時避光配制。健康成熟未交配雌性Wistar大鼠(60d～70d)，每只體重190g～240g(由中山大學動物實驗中心提供。兔抗大鼠CD34和血管內皮生長因子(VEGF)單克隆抗體為Santa Cruz產品，ABC試劑盒購自武漢博士德生物技術有限公司。

1.2建立大鼠子宮內膜異位癥模型參考Zulfikaroglu[4]方法，選用成熟雌性Wistar大鼠，切取子宮角組織一塊，分離出內膜組織并將其縫合在腹膜上，子宮內膜面向腹腔。

1.3實驗分組模型手術后3w，第2次開腹，將造模成功者隨機分為兩組(5只/組)：治療組用灌胃法每日喂服吲哚美辛(5mg·kg-1·d-1)；對照組喂服0.2%的DMSO-生理鹽水液。連續喂服4w。

1.4免疫組織化學染色每只大鼠在治療結束后24 h內處死，立即手術取異位內膜組織，常規處理，10％多聚甲醛溶液中固定24 h，石蠟包埋，連續切片(5μm)，行CD34和VEGF免疫組織化學染色。CD34和VEGF染色均采用ABC法（卵白素-生物素-酶復合物染色法），參照試劑盒說明逐步操作。各組標本同一批染色，以PBS代替一抗作陰性對照。

子宮內膜微血管密度(MVD)計算方法：CD34標記微血管，計數子宮內膜內著色的毛細血管和微小血管。參考Guset[5]的評估標準，凡呈現棕色單個內皮細胞或內皮細胞簇均作為1個血管計，但肌層較厚及管腔面積大于8個紅細胞直徑的血管不計數。計數方法，首先用10×10低倍鏡頭掃視整張切片，確定微血管最密集的3個視野(新生血管熱點區)，然后在高倍鏡(10×40)視野范圍內計數所有染色的微血管。取3個視野計數結果的均數為該切片的微血管數。

VEGF判斷標準：VEGF蛋白表達均以細胞質或細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性。參考Guset[5]的方法判斷染色結果，根據細胞染色強度分為4級，并分別計分：陰性為細胞無著色(0分)；弱陽性為淺黃(1分)；中度陽性為棕黃(2分)；強陽性為棕褐(3分)。在每張切片上隨機選取10個視野(10×10)，計數每一強度視野數所占的比率(F)，根據下列公式計算每張切片的平均染色強度。IS(intensity score)=∑[(0×F0)+(1×F1)+(2×F2)+(3×F3)]，F=10×視野%。

1.5統計學處理所有數據采用SPSS 11.0 統計軟件分析。兩組均數比較分別采用Student's t-test。

2結果

子宮內膜組織內MVD及VEGF表達CD34標記血管內皮細胞，所有子宮內膜組織均有陽性表達。內皮細胞被染成棕黃色，微血管有的形成管腔，有的僅為單個內皮細胞或內皮細胞簇(圖1)。治療組內膜組織中MVD明顯少于對照組(P<0.05)。內膜的腺上皮細胞均有VEGF表達，而間質細胞中散在表達，血管內皮細胞幾乎不表達(圖2)。治療組與對照組比較，VEGF表達有顯著差異(P<0.05)，見表1。

圖1 CD34標記微血管(ABC法，×400)

圖2 VEGF表達于子宮內膜細胞胞質(ABC×400)

3討論

新生血管形成在子宮內膜異位癥的發生發展過程中起著重要作用。人們逐漸將注意力集中在血管生成的生物學基礎上，研究減弱血管生成的介質，尋求抑制血管生成治療子宮內膜異位癥的治療方案。VEGF是目前已知最主要的血管生成因子，在機體生理性和病理性血管生成過程中發揮關鍵的調節作用，可選擇性作用于血管內皮細胞膜上的酪氨酸激酶受體，通過磷酸肌醇特異性磷脂酶C使細胞內IP3濃度升高而發揮作用，從而促進不同來源的內皮細胞分裂增殖和血管構建，促使內皮細胞的遷移和血管內物質的滲漏，是阻斷子宮內膜血管生成比較理想的靶位[6，7]。近年研究發現，環氧合酶2(COX-2)在子宮內膜異位癥的內膜表達增高，與該病密切相關[8]。COX-2可通過抑制細胞凋亡途徑促進子宮內膜異位病灶的生長，主要是通過調節抗凋亡蛋白和促凋亡酶的表達來起作用;COX-2還可通過血管生成途徑促進異位子宮內膜細胞增殖生長，這種作用是基于提高促血管生成因子的表達來實現的[8]。Ebert等[9]提出使用COX-2抑制劑有望治療子宮內膜異位癥。 Jones等[10]證實吲哚美辛和NS-398(選擇性COX-2抑制劑)在體外可抑制3種不同的血管內皮細胞形成血管，提示COX-2在體外血管形成過程中起到關鍵作用。本實驗選用吲哚美辛(非選擇性COX-1和COX-2抑制劑)治療大鼠子宮內膜異位癥，通過免疫組化染色檢測MVD和VEGF，結果顯示治療組子宮內膜組織中的微血管明顯比對照組減少，治療組VEGF的表達也顯著減少。由此得出結論：吲哚美辛可減少子宮內膜中新生血管的生成，其機制與直接或間接抑制血管生長因子VEGF的表達有關。大量研究表明，吲哚美辛等NSAIDS可作用于血管內皮細胞，從而抑制新生血管生成[11-14]。

吲哚美辛為吲哚類非甾體抗炎藥，由美國默克（merck）公司最先研制，早在1963年就被推薦到臨床治療類風濕性關節炎。但由于它有嚴重的副作用，尤其不適于高齡患者和有胃潰瘍及高血壓的患者，其對胃粘膜的副作用主要是由于抑制胃粘膜的COX-1并阻礙肉芽組織血管生成[15]，誘發潰瘍性疾病，影響潰瘍愈合。因此，有必要進一步探討非甾體抗炎藥影響生理性與病理性血管生成的確切機制，加強對此類藥物功能及副作用機制的了解，提高藥物應用的安全性和有效性。

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編輯/申磊