esp1基因Tet-on載體的構建及在Hela中的可調控性表達

摘要：目的構建esp1- pTRE-d2EGFP可調控真核表達載體，檢測其在Hela 細胞內的表達情況。方法將esp1導入pTRE-d2EGFP載體中。用脂質體將pTet-on、PTK-Hyg 和esp1-pTRE-d2EGFP共轉染入Hela細胞， 以不同濃度的DOX誘導， 用Real-time PCR、Western blot檢測esp1表達水平。結果我們構建的可調控性表達載體能在Hela細胞內表達， 不同濃度藥物誘導的esp1表達水平明顯不同。結論成功構建了esp1- pTRE-d2EGFP真核表達載體， 并可在Hela細胞內表達。為進一步觀察esp1與腫瘤發生、發展的關系奠定了基礎。

關鍵詞：esp1；Hela ；pTet-on；PTK-Hyg ；esp1-pTRE-d2EGFP

中圖分類號：R392.12 文獻標識碼：A

esp1基因表達一種分離酶(separase) 在遺傳信息的傳遞中發揮重要作用。我們以esp1為靶基因構建一種可調控的真核表達載體， 以實現人為控制的esp1的表達[1，2]。本研究應用Tet-on系統調控esp1的表達，在低于DOX毒性劑量時就可以發揮誘導作用。其可控性、高表達效率和低表達背景特征，已成為研究基因功能、進行疾病基因治療的有力武器[3]。為將來應用于動物模型， 方便快捷地研究分離酶在腫瘤細胞過度增殖中的機制奠定基礎。

1資料與方法

1.1一般資料Hela，PSK-esp1質粒，pTet-on、PTK-Hyg 、pTRE-d2EGFP（購自Clontech 公司），DMEM培養基（Hyclone美國），小牛血清（蘭州民海生物），Tipure（Roch公司），逆轉錄試劑盒（Promega公司），PCR試劑（寶生物公司），引物（Invitrogen公司），強力霉素(DOX)（深圳晶美生物有限公司）。

1.2方法

1.2.1 Tet-on 系統esp1表達調控模型的構建

1.2.1.1 esp1目的基因片段的獲得載體PSK-esp1質粒用EcoR Ⅰ， Sac Ⅱ雙酶，膠純化回收試劑盒回收純化6662bp的目的片段。

1.2.1.2 esp1-pTRE-d2EGFP質粒的構建利用T4DNA連接酶連入EcoR Ⅰ單酶切后的pTRE-d2EGFP載體，轉化入DH5α感受態菌，利用青霉素平板篩選，挑取單個菌落用LB培養基擴增，抽取質粒酶切鑒定，鑒定正確的質粒送上海英駿公司測序驗證。

1.2.1.3 PTet-on 質粒的轉染在轉染前將6 孔板中Hela細胞的培養液換為無血清培養液，選擇如下轉染比率3∶1、3∶2、6∶1;無血清培養基97、97、94μl;轉染試劑3、3、6μl 待轉染質粒1、2、1μg。最后將混合試劑室溫放置15～45min，滴入待轉染的已換無血清培養基的細胞中進行轉染。轉染8h 后換新鮮有血清培養基，轉染24h 后加G418 (200ng/ml)，篩選2w后挑選單個細胞克隆擴大培養。

1.2.1.4 PTK-Hyg 質粒和esp1-pTRE-d2EGFP質粒的共轉染將轉染pTet-on 質粒成功的Hela細胞克隆傳入6孔板，細胞密度為1×105 個/ml。篩選2w后挑選單個細胞克隆擴大培養。

1.2.2 Real-time PCR檢測DOX誘導下Tet-on 系統調控esp1的表達

1.2.2.1 DOX半衰期為24h，有效濃度為100~1000 ng/ml，撤藥5d后表達恢復原來水平；

1.2.2.2細胞RNA 提取；

1.2.2.3 RNA 逆轉錄 cDNA；

1.2.2.4定量PCR反應①構建反應體系；②標準曲線的制作；③數據處理。

實驗數據用C(T)及拷貝/μl表示，實驗組和對照組測得拷貝數均除以各自內參，結果采用SPSS10.0軟件獨立樣本t檢驗分析，P<0.05表示差異具有顯著性意義，P<0.01表示差異具有非常顯著性意義。

1.2.3 WB檢測強力霉素誘導下Tet-on系統調控分離酶的表達 ①細胞總蛋白的提取；②SDS－PAGE電泳；③轉膜；④免疫反應。

1.2.4 Hela細胞染色體的制備①細胞生長至覆蓋瓶底面積70%時加入秋水仙素，使終濃度為40ng/ml，繼續培養1.5h。②棄培養基，用PBS 洗1次，0.25%胰蛋白酶消化細胞，172.5×g離心6min，棄上清。③加入預熱至37℃的0.075mol/L低滲液KCl，至10ml，混勻， 37 ℃低滲處理20min，172.5×g離心6min，去上清。④加固定液甲醇-冰醋酸(3:1)至10 ml，混勻，固定30 min，然后172.5×g離心6min，棄上清。⑤重復2~3次，固定30min/次。⑥固定完畢，加入0.2ml 固定液，制成懸液，滴一滴在冰冷的玻片上，酒精燈外焰烤干，72℃烤箱2~3h。⑦姬姆莎染色，加入適量的碳酸氫鈉溶液10min，清水沖洗，晾干。

2結果

2.1 Tet-on系統esp1表達調控模型的鑒定

2.1.1 esp1-pTRE-d2EGFP構建質粒電泳鑒定采用XhoⅠ，SphⅠ雙酶切鑒定插入方向，若正向插入則片段為8520bp/2100bp，若反向插入則片段為5800bp/4820bp，酶切鑒定結果如圖為正向插入，見圖1。

1:λDNA HindIII marker(23130/9416/6557/4361/2322/2027/564/125bp，from up to down);2:esp1-pTRE-d2EGFP/ XhoⅠ＋ SphⅠ

圖1含esp1片段的esp1-pTRE-d2EGFP載體的酶切鑒定

2.1.2 esp1-pTRE-d2EGFP構建質粒PCR鑒定在esp1目的基因片段上設計引物，FP:5'TGCTACCACGACTTTACGC3'，RP:5' AACGATCTTCCTGGAGTT

TAT 3'。已構建質粒為模板，PCR，電泳，目的條帶大小約274bp，與預期相符，見圖2。

1：200bp DNA ladder，（4000/2200/2000/1800/1600/1400/1200/1000/800/600/400/200bp，from up to down）；2：esp1-pTRE-d2EGFP with PCR amplification

圖2含esp1片段的esp1-pTRE-d2EGFP載體的PCR擴增電泳鑒定

2.2Real-time PCR檢測強力霉素誘導下Tet-on系統調控分離酶的表達，見表1。

2.3 WB檢測強力霉素誘導下Tet-on 系統調控分離酶的表達，見圖3。

圖3 WB檢測esp1基因在Hela細胞中的表達

（1：Hela細胞；2、3、4、5、6：pTet-on-esp1- Hela細胞）（DOX濃度依次0/0/100/200/400/800ng/ml）

2.4.Hela細胞染色體結果

2.4.1染色體的形態秋水仙素法處理人淋巴細胞及經過DOX誘導的轉染前后的Hela細胞，制備染色體，見圖4。

A：淋巴細胞； B：Hela細胞； C：pTet-on-Hela細胞；

D：pTet-on-esp1-Hela細胞

圖4轉染前后染色體分裂相（姬姆薩染色×1000）

2.4.2染色體的數目DOX濃度以最適誘導濃度200ng/ml誘導后，對正常人淋巴細胞、Hela細胞、pTet-on-Hela細胞染色體影響不明顯(P>0.05)，對pTet-on-esp1-Hela細胞染色體影響顯著（P<0.01），見表2。

3討論

esp1的結構具有進化保守性，其表達的活性蛋白在姐妹染色單體的分離中發揮重要作用。esp1基因定位于VII號染色體，多數為高分子蛋白質，是高度水溶性蛋白，約150-230kDa[4]。

我們成功構建了esp1基因的真核表達載體esp1-pTRE-d2EGFP， 并轉染進Hela細胞。通過不同濃度的DOX誘導該表達載體，觀察到最適的DOX誘導濃度為200ng/ml。以該濃度誘導轉染的Hela細胞后， esp1表達水平明顯升高，細胞染色體數目降低[5，6]。這一結果初步提示，分離酶表達增加，Hela細胞染色體數目減少，惡性程度降低。本實驗中構建的esp1-pTRE-d2EGFP載體為進一步建立轉esp1基因動物模型， 探討esp1對腫瘤細胞增殖作用的機制奠定了基礎。

參考文獻:

[1]Irene C. Waizenegge， Hauf S， Meinke A et al. Two Distinct Pathways Remove Mammalian Cohesin from Chromosome Arms in Prophase and from Centromeres in Anaphase cell[J].2000 103:399-410.

[2]Díaz-Martínez LA， Giménez-Abián JF， Clarke DJ. Cohesin is dispensable for centromere cohesion in human cells[J].PLoS ONE，2007，2(3):e318.

[3]Schmeisser F， DonohueM， Weir JP. Tetracycline-regulated gene expression in rep- lication-incompetent herpes simp lex virus vectors [J].Hum Gene Ther， 2002， 13 (18) : 2113 - 3124.

[4]Chestukhin A，Pfeffer C，Millig S， et al. Processing， localization， and requirement of human separase for normal anaphase progression[J].PNAS，2003，100(8):4574-4579.

[5]Losada A. Cohesin regulation: fashionable ways to wear a ring[J].Chromosoma. 2007 Aug;116(4):321-9. Epub 2007 Mar 1. Review.

[6]Uhlmann F. Secured cutting: controlling separase at the metaphase to anaphase transition[J].EMBO reports 2001 6:487-492.

編輯/申磊