復制蛋白A與肝癌DNA損傷修復的研究進展

復制蛋白A是目前國內外研究細胞 DNA損傷修復的熱點之一。RPA 是真核細胞中主要的單鏈結合蛋白，包含RPA1，RPA2和RPA3三個亞單位。RPA在 DNA復制和修復過程中起著重要的作用。DNA復制時，RPA具有解鏈、結合單鏈模板并維持 DNA 連續復制的功能；DNA 損傷時，RPA與具有染色體結構維持、保護、修復功能的蛋白質聚集在DNA損傷位點，共同完成對 DNA 損傷的檢測并進行修復。因此RPA對于細胞調控DNA修復過程至關重要。目前肝癌的發生機制尚未完全闡明，但其發生與DNA的損傷積累密切相關。誘發肝癌的主要危險因素包括乙型肝炎病毒，黃曲霉毒素B1，亞硝胺等，這些誘因不僅能夠引起肝細胞DNA的損傷，而且能直接或間接影響損傷修復系統，使DNA修復障礙，從而導致肝癌的發生。本文就RPA在DNA損傷修復中起到的重要作用及其肝癌DNA損傷修復的關系作一綜述。

1復制蛋白A的結構

復制蛋白A（replication protein A，RPA）是真核細胞單鏈DNA（single stranded DNA，ssDNA）結合蛋白，ssDNA是細胞中普遍存在且相對重要的物質，在ssDNA形成過程中RPA發揮重要作用。RPA共由70，34和14-kDa 3個亞單位組成，通常各自稱為RPA1，RPA2，RPA3。每個亞單位都含有至少一個DNA 結合結構域（DNA binding domain，DBD）。RPA1含有4個DBD結構域，分別稱為，DBDA，DBDB，DBDC和DBDF。其中DBDA，DBDB的DNA結合活性最強，DBDC與其他兩個亞單位形成復合物過程中起著非常重要的作用。兩個較小的亞單位RPA2和RPA3分別含有DBDD和DBDE，有較弱的DNA 結合活性。RPA1，RPA2含有磷酸化位點，正常細胞周期中可被細胞周期蛋白與細胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin and cycle dependent kinase，cyclin-CDK）磷酸化[1]。

2復制蛋白 A與DNA損傷及修復

DNA是機體生命活動中最重要的遺傳物質，其結構完整性和穩定性的保持對于細胞的正常生理活動具有重要意義。但是DNA面臨來自于生物體內部和外部的侵襲，內外各種因素的作用下可不斷出現DNA損傷。盡管如此，細胞仍能保持正常的生長、分裂和繁殖，說明基因組處于有效的監控之下。生物體基因組完整性和穩定性的維持依賴于體內DNA修復系統。細胞通過周期阻滯修復DNA或者細胞凋亡對DNA損傷產生反應。而如果細胞對DNA損傷異常反應將導致疾病的發生，例如腫瘤。

2.1 DNA損傷修復DNA損傷修復是保持細胞基因組完整性的重要機制。DNA損傷修復是一個多因素、多步驟的復雜過程。針對不同形式的損傷其修復方式也大不相同，DNA修復方式主要有以下幾種：堿基切除修復（base excision repair，BER），主要負責切除或替換由內源性化學物質引起的堿基修飾或單鏈斷裂；核苷酸切除修復（nucleotide excision repair，NER），針對DNA鏈螺旋扭曲損傷、鏈內交聯及某些形式的氧化損傷；錯配修復（DNA mismatch repair，MMR），主要針對一些由DNA損傷試劑引起堿基錯配以及在DNA復制和重組過程中單個堿基的錯配和小的插入或缺失；雙鏈斷裂修復（double strand break，DSB repair），主要針對DNA雙鏈斷裂的修復。

2.2復制蛋白 A和核苷酸切除修復當DNA出現損傷時，RPA參與DNA損傷識別，RPA與著色性干皮病A蛋白（Xeroderma Pigmentosum GroupA，XPA）形成RPA-XPA復合物，此復合物與受損DNA的結合能力要強于RPA或者XPA，且此復合物與受損的DNA的結合能力要強于未受損的DNA[2]。他們招募通用轉錄因子 （transcription repair factor IIH，TFIIH）到達損傷部位。然后TFIIH的兩個亞基XPB和XPD打開損傷的DNA，然后由DNA切除修復交叉互補基因和DNA修復基因F異二聚體（ERCCI/XPF）切除損傷DNA的5'端，DNA修復基因XPG切除3'端，去除包含損傷部位的寡核苷酸片段，隨后由DNA聚合酶填充于該間隙，合成新的DNA，最后由DNA連接酶補平缺口[3]。

2.3復制蛋白 A和堿基切除修復RPA在堿基切除途徑中的作用尚不明確，已經證實的是RPA在堿基切除修復途徑中與細胞核內尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG2） 和 DNA修復酶hMYH相互作用，從而定位受損的DNA位置。在堿基切除修復的最后階段，RPA起到激活DNA連接酶Ⅰ的作用[4]。

2.4復制蛋白A和DNA錯配修復Lin YL等[5]研究顯示，RPA1結構上的點突變形成的突變型RPA并不支持MMR，但卻支持NER，此研究表明RPA有多種途徑與相關蛋白相互作用從而對DNA修復產生影響。在MMR中，RPA可以結合ssDNA防止核酸酶的降解。當堿基錯配發生時，RPA還可以激活Exo1途徑進行DNA修復，當修復完成后，RPA隨即終止此途徑[6]。Guo等[7]證實，在MMR途徑中RPA與ssDNA結合后，磷酸化后的RPA2與RPA1的 DBD F結構域結合，從而降低與ssDNA結合能力。

2.5復制蛋白 A與DNA雙鏈斷裂修復當DNA雙鏈斷裂時，首先是 MRN 復合物（Mrell-Rad50-Nbsll）切割雙鏈斷裂的 DNA （DNA double-strand breaks， DSBs）末端產生 3′ 突出。RPA與ssDNA形成的復合物會聚集在斷裂部位的3′端，保護DNA阻止二級結構形成，隨后RPA通過與Rad52蛋白相互作用形成RPA-Rad52復合物，RPA-Rad52復合物提高了結合ssDNA的能力。此復合物在Rad52上形成含有Arg-Gln-Lys序列的結構域，隨后Rad52與RPA2的C端相互作用，在Rad52上形成酸性結構域，此酸性結構域對DNA修復至關重要，并且Rad52上的酸性結構域可以調節此復合物與ssDNA的結合能力[8]。在Rad52的調控下RPA從ssDNA上脫離，然后Rad51結合在ssDNA的3′端，促進同源 DNA間進行鏈交換，修復可能的缺失并連接DNA 鏈的斷裂，隨后RPA磷酸化。磷酸化的RPA更頻繁的與Rad51 和Rad52相互作用，結果是降低與RPA與ssDNA的結合能力。

3肝癌與 DNA 損傷

人體細胞經常受到多種體內外因子的影響，這些因素中會造成各種各樣的 DNA損傷，如果損傷被正確修復，細胞存活，如果修復過程中出現缺失插入等不正確的修復，這些異常堿基的累積就可能導致癌癥的發生。目前肝癌的發生機制尚未完全闡明，但其發生與DNA的損傷積累密切相關。誘發肝癌的主要危險因素包括乙丙型肝炎病毒，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1），亞硝胺，氧化應激等，這些誘因不僅能夠引起肝細胞DNA的損傷，而且能直接或間接影響損傷修復系統，使DNA修復障礙，從而導致肝癌的發生。其中HBV表達的HBx是一個多功能蛋白，它具有調控細胞凋亡，基因穩定性等作用，它是 HCC 發生的一個重要影響因子。它能與TFIIH結合，抑制DNA修復并且引起DNA損傷以及損傷積累，最終導致肝癌的發生。氧化應激則是導致體內高活性分子如活性氧自由基產生過多，氧化系統和抗氧化系統失衡，從而導致組織損傷。AFB1的作用機制主要是誘導AFB1-DNA結合物的形成并且引起DNA鏈斷裂，DNA堿基突變以及氧化損傷，進而導致癌癥的發生[9]。因此，對于致癌因素的發生機制已經有所了解，但是還未完全闡明，在以后的研究中還需著手于信號通路的研究，從其發生本質上研究，為以后肝癌的治愈提供理論基礎。

4RPA的臨床研究

腫瘤患者體內會出現識別腫瘤相關抗原的自身抗體。J.E.Tomkiel等[10]采用ELISA方法檢測乳腺癌患者及對照正常人血清中的RPA2的自身抗體，結果顯示801例乳腺癌患者中有87例表達顯著升高，39例原位癌患者中有4例RPA表達明顯升高，65例正常人中無1例RPA2表達異常。因此他們認為RPA2在乳腺癌中是一種自身抗原，可以作為腫瘤診斷指標。但RPA2的表達水平與患者的預后，腫瘤轉移臨床特征等沒有相關性。同時他們又用同樣的方法檢測了22例肺癌患者和35例頭頸部腫瘤患者的RPA2抗體表達情況，結果有1例肺癌患者及2例頭頸部腫瘤患者RPA2抗體表達異常升高。Nikolaos Givalos等[11]運用免疫組化法檢測RPA1、RPA2在130例結腸癌中的表達，結果顯示RPA1、RPA2在癌組織中高表達，且與患者的臨床分期、淋巴結轉移及不良預后有關。他們推測RPA在臨床分期高的組織中表達越高的原因是RPA參與DNA的修復，臨床分期越高的腫瘤組織中DNA損傷越多，故RPA反饋性的表達升高。RPA在結腸癌組織中的高表達可能不是RPA基因突變的結果，Popandaet等[12]發現RPA蛋白在結腸癌組織中的氨基酸序列沒有改變。Levidou G等[13]報道RPA1和RPA2在膀胱癌中同樣過度表達。有趣的是，隨著腫瘤的臨床分期的升高，RPA的表達越少。他們推測RPA在腫瘤形成的早期有著重要作用，隨著腫瘤的進展RPA的作用逐漸減弱，這與先前RPA在其他腫瘤中的表達情況相反。國內于大海等[14]檢測RPA1和RPA2在食管癌中的表達情況，RPA1和RPA2在食管癌組織中高表達，與臨床分期、淋巴結轉移、組織分級等病理特征具有相關性，得出RPA有望成為預測食管癌患者預后的指標。這些有關RPA的臨床研究表明，RPA有可能成為預測腫瘤發生發展的重要指標。

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編輯/哈濤