肝癌患者外周血腫瘤相關抗原MAGE-A1 A3表達與意義

摘要：本文通過巢式RT-PCR方法檢測60例HCC患者外周血單核細胞(PBMC)中MAGE-A1，A3mRNA表達，以30例健康志愿者外周血標本作為對照組，進行MAGE-A1，A3mRNA和AFPmRNA對比檢測。結果顯示MAGE-A1，A3在HCC患者外周血中高表達，可聯合AFP作為特異性腫瘤標記物用于肝癌患者的檢測。

關鍵詞：肝癌，黑色素瘤抗原基因；巢式逆轉錄聚合酶鏈反應

肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，早期發現與診斷是提高臨床治愈率的有效手段。本試驗采用巢式反轉錄聚合酶鏈法檢測編碼腫瘤相關抗原的黑色素瘤抗原(melanoma antigen，MAGE)MAGE-A1和MAGE-A3基因在HCC外周血中的表達，并對檢測結果的臨床意義進行了初步探討。

1資料與方法

1.1一般資料實驗組為2011年1月~2013年6月沈陽市第四人民醫院肝膽外科收治的HCC患者60例，伴有乙型肝炎病毒陽性46例。男女比例為2:3，年齡38~72歲，平均56.3歲。患者均行手術完整切除病灶，并經術后病理證實。30例健康志愿者外周血標本作為對照組，男22例，女8例，年齡32~45歲，平均37.4歲。外周血標本的采集 HCC癌患者外周血(10ml)在術前1d采集。對照組血標本擇期采集。使用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）。引物:根據Genbank數據庫中所查MAGE-A1，A3基因序列，使用Omiga2軟件設計引物。試劑:Trizol試劑購自美國Gibco公司，脫氧核苷酸（dNTPs)購自Pharmacia公司，RNA逆轉錄酶(MMLV)和TaqDNA聚合酶購自Promega公司。

1.2方法

1.2.1總RNA提取 取1×107個PBMC加入Trizol試劑1ml裂解，經三氯甲烷分層、異丙醇沉淀，75%乙醇洗滌干燥后，將所得RNA溶于無RNA酶的純水中，采用紫外分光光度計(Beckman公司.1DU 640)對其定量后再進行cDNA合成和RNA電泳。

1.2.2 cDNA合成 反應體系及反應條件為:MgCl2 4μL，10×Buffer2μL，dNTP2μL， Oligo(dT)1μL，RNasin0.5μL，AMV酶5μL，Template4μL，加無RNA酶的雙蒸水補足20μL。42℃孵育30 min，95℃滅活酶活性5min，-20℃凍存備用。

1.2.3 Nested RT-PCR反應體系為:MgCl23μL，10×Buffer5μL，dNTP1μL，引物sense 1μL。引物antisense1μL。Taq聚合酶0.5μL，cDNA 5μL，加無RNA酶的雙蒸水補足50μL。以MAGE-A1，A3，AFPmRNA為靶基因時，PCR循環條件參照文獻[1，2]。終產物分別在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳，紫外燈下觀察DNA條帶，凝膠成像分析儀照相。

1.3統計學方法 使用SPSS 10.0軟件建立數據庫，使用χ2檢驗和四格表確切概率法。

2結果

2.1 MAGE-A1，A3mRNA在HCC患者外周血中的表達情況RT-PCR電泳顯示：所有內參照均為陽性。健康者外周血中未檢測到MAGE-A1，A3mRNA的表達。60例HCC患者癌組織中MAGE-A1mRNA表達的陽性率為38.0%（23/60），MAGE-A3mRNA表達的陽性率為48.3%(29/60)，AFPmRNA表達的陽性率為73.3%(44/60)均高于癌旁組織（0%）(P<0.01)。

2.2MAGE-A1，A3mRNA和AFPmRNA在HCC患者外周血中聯合表達情況60例HCC中，至少表達1種MAGE基因的42例，表達率為70%；表達2種MAGE基因的19例，表達率為33%，58例HCC患者至少表達1種基因，表達率為96.7%。MAGE-A1mRNA/AFPmRNA陽性表達20例，表達率為33.3%。MAGE-A3mRNA/AFPmRNA陽性表達26例，表達率為43.3%。MAGE-A1，A3mRNA/AFPmRNA陽性表達16例，表達率為26.7%。

2.3MAGE mRNA表達與臨床有關指標的關系60例HCC中MAGE-A1，A3mRNA表達與患者性別、年齡、有無包膜以及乙型肝炎病毒感染等指標無關(P>0.05)；與腫瘤大小及AFP水平存在相關性(P<0.05)

3討論

潛伏腫瘤細胞(OTC)是與患者預后有關的危險因素。肝癌患者外周血OTC的檢測己經成為研究的熱點。

本研究顯示，60例HCC患者癌外周血中MAGE-A1，A3mRNA均有較高表達，70%至少表達1種MAGE基因。聯合AFP檢測后，96.7%的HCC患者至少表達1種基因，高于單一檢測AFP的表達率（73%）。對比臨床資料發現MAGE-A1，A3mRNA的表達與腫瘤大小及AFP水平均存在相關性，提示檢測血清中MAGE-A1，A3基因的表達，可能作為HCC的輔助診斷指標之一。

對比國外的相關研究資料其MAGE-A1，A3mRNA表達率均明顯高于本研究，這些差異與樣品量的不同或患者的選擇和地區的差異有關。國外報道的病例多為丙型肝炎病毒陽性。

綜上，提示我們可以以MAGE-A1，A3基因作為HCC患者特異性腫瘤標記物，為HCC患者的診斷和治療提供幫助。

參考文獻：

[1]Kufer P，Zippelius A，Lutterbuse R，et al.Heterogeneous expression of MAGE-A genes in occult disseminatedtumor cells a novel multimarker reverse transcription-polymerase chain reaction for diagnosis of micrometastatic disease[J]．Cancer Res，2002，62，251-261.

[2]Komeda T，Fukuda Y，Sando T，et al.Sensitivedetectionof circulating hepatocellular carcinoma cells in peripheral venous blood[J]．Cancer，1995，75，2214-2219.

編輯/許言