氯通道阻斷劑DIDS對NO誘導大鼠海馬神經元凋亡的影響

摘要：目的探析氯通道阻斷劑DIDS對NO誘導大鼠海馬神經元凋亡影響。方法將培養12d細胞采用Hoechst33258與神經元特異性抗體抗Neun抗體雙染方法鑒定成熟神經元。經過前期藥物濃度梯度監測，確定SIN-1與DIDS的最佳濃度，最后監測各組神經元凋亡。結果經過Hoechst33258與神經元特異性抗體抗Neun抗體雙染方法鑒定定成熟神經元純度可達到92%以上，確定SIN-1與DIDS的使用濃度為1mmol/L、0.1mmol/L。Control組有很少的凋亡細胞出現，在SIN-1組顯示有大量凋亡細胞，而在DIDS組可以觀察到少量細胞發生凋亡。結論氯通道阻斷劑DIDS可以通過某種機制減少NO誘導劑SIN-1誘導的神經元凋亡。

關鍵詞：氯通道；DIDS；海馬研究表明細胞凋亡在許多病理性神經細胞死亡所導致的疾病發揮了重要作用[1]。本實驗用NO供體SIN-1誘導大鼠海馬神經元發生凋亡，通過觀察氯通道阻斷劑DIDS對凋亡大鼠海馬神經元凋亡的影響，探討氯通道在缺血性腦損傷中的作用。

1材料與方法

1.1實驗動物新生24h內 SD大鼠10只。

1.2主要試劑DMEM/F12高糖培養基，Neurobasal培養基，Anti-NeuN clone 抗體，熒光標記的二抗IgG，Hoechst33258

1.3儀器雙人雙面潔凈工作臺，倒置熒光顯微鏡，二氧化碳培養箱

1.4海馬神經元的鑒定參照方法用Hoechst33258和神經元特異性抗體抗NeuN抗體雙染。倒置熒光顯微鏡下觀察并攝像。

1.5細胞凋亡的檢測DNA熒光染色是目前常用的比較簡單的觀察細胞凋亡的方法。用DNA熒光素Hoechst33258對細胞進行染色，表現為正常細胞為藍色，凋亡細胞為淺藍色。每次隨機數三個視野內200個細胞左右，記陽性細胞凋亡（%）。

2結果

2.1用Hoechst33258DNA熒光素對神經元內細胞核進行染色（圖1a），正常海馬神經元胞核光滑，呈卵圓形，折射出染色熒光（圖1b），用特異性的神經元熒光標記物體抗NeuN抗體染色后進一步證實培養的細胞主要是神經元(1c)，占總細胞的92%以上。

圖1 正常條件下培養的新生SD大鼠海馬神經元免疫熒光觀察（200X)

2.2氯通道阻斷劑對SIN-1誘導海馬神經元損失細胞形態學觀察圖中觀察。在Control組有很少的凋亡細胞出現（14.34±2.10%），而在SIN-1組顯示有大量凋亡細胞，而在DIDS組可以觀察到有少量細胞發生凋亡。方差分析顯示各組凋亡細胞計數有統計學意義（F=245.471，P＜0.05）；LSD統計結果顯示：SIN-1組與Control組相比，P＜0.05;SIN-1+DIDS組與SIN-1組相比，P＜0.05（n=6）。

Control組SIN-1組 SIN-1+DIDS組

圖2 各組離體培養海馬神經元DNA熒光染色的形態學變化

3討論

目前認為缺血后的遲發性神經元的死亡主要是通過凋亡實現的。在本研究中，我們發現SIN-1作為NO供體，可以誘導海馬神經元發生凋亡，該結果與文獻報道相符。這是由于SIN-1在水中可以分解產生NO和O2-并形成OONO- [2]，過量NO和OONO-的產生可以使NO和OONO-沿不同途徑對神經元產生毒性作用。如NO和OONO-可以破壞神經元內Ca2+穩態，另外NO供體能增加細胞內神經酰胺濃度，從而抑制BCL-2基因表達，從而誘導多種類型細胞發生凋亡。腦缺血后腦組織可以通過氧化應激，產生過量的NO，從而產生缺血性腦損傷。

有報道，Cl-穩態遭到破壞可以導致細胞凋亡，氯通道阻斷劑DIDS能有效抑制caspase-3激活誘導的細胞凋亡[3]。在心臟缺血再灌注損傷模型中，發現DIDS可以通過p13-k/Akt途徑減弱缺血再灌注損傷所誘導的心肌細胞凋亡[4]。氯通道在神經細胞凋亡中的作用目前研究較少，在STS誘導培養的大鼠皮層和海馬神經元凋亡模型上，氯通道阻斷劑SITS和DIDS對神經元的凋亡具有明顯保護作用，有學者在研究鈣通道在SIN-1誘導的大鼠海馬神經元凋亡中的作用時，發現不是鈣通道活動而是氯通道的活動參與了SIN-1誘導的神經元的凋亡。由此，我們推斷氯通道阻斷劑DIDS可能通過某種機制干預了應激狀態下的神經元的凋亡過程，對神經元起到了保護作用。

參考文獻：

[1]Kristian P. Mechanisms of ischemic brain damage .Neuropharcology. 2008，55(3):310～318.

[2]Maeno E， Ishizaki Y， Kanaseki T， et al. Normotonic cell shrinkage because of disorder volume regulation is an early prerequisite to apoptosis[J].Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（17）：9487-9492.

[3]張衛衛，劉艷.DIDS對Bcl-2/Bax在STS誘導心肌細胞凋亡中表達的影響[J].心臟雜志2009（3）：313～316.

[4]Quanzhong Chang， Shuling Zhang， Yuanyin Zheng ，et al.Effects of calcium on 3-morpholinosydnonine-induced rat hippocampal neuroal apoptosis[J].Neural Regen Res，2011，6(5):373-377.

編輯/孫杰