五分類血液分析儀技術原理與展望

隨著電子技術、流式細胞技術、激光技術、電子計算機技術和新熒光化學物質等各種高新技術在血細胞分析儀中的應用使血細胞分析儀的檢測原理不斷完善、測量參數不斷增加、檢測水平不斷提高尤其在白細胞五分類技術方面，已發展到利用多項技術（如射頻、細胞化學染色、流式細胞術和熒光染色技術等）聯合同時檢測一個白細胞再用先進的計算機技術區分、辨別經上述方法處理后的各自細胞間的細胞差別綜合分析實驗數據，得出較為準確的白細胞分類結果。為臨床疾病的診斷、治療提供了重要的實驗室依據。近年來，可以對白細胞進行五分類計數的血細胞分析儀已經普遍使用。本文就目前血細胞五分類測定中常用技術及其最新應用進展作一綜述。

1血細胞五分類技術的原理

1.1流式細胞術[1] 流式細胞術（flow cytometry，FCM）是一種綜合應用光學、機械學、流體力學、電子計算機、細胞生物學、分子免疫學等學科技術，使被測溶液流經測量區域，并逐一檢測其中每一個細胞的物理和化學特性，從而對高速流動的細胞或亞細胞進行快速定量測定和分析的方法。

首先，待測細胞經處理或染色后被壓人流動室，與此同時，不含細胞的緩沖液在高壓下從鞘液管噴出，鞘液管人口方向與待測樣品流成一定角度，這樣鞘液就能被包繞著樣品高速流動，組成一個圓形的流束，待測細胞在包繞下單行排列，依次通過檢測區域在激光束的照射下產生散射光和激發熒光。這兩個光源信號分別反映了細胞體積的大小和內部的信息經光電倍增管接收后可轉換為電信號，再通過模，數轉換器將連續的電信號轉換為可被計算機識別的數字信號，經計算機處理，可將分析結果顯示在屏幕上。

為了保證細胞單個排列地逐一通過檢測區域，鞘流技術在流式細胞術中被廣泛應用。根據層流理論，由于兩種液體的流速和壓力不同。在一定條件下樣品溶液與包裹它的鞘液在流動中可以保持相互分離并且同軸。同時鞘液流可以加速樣品溶液中顆粒的流動并迫使他們的流動軌跡保持在液流的中軸線上，使細胞單排列地逐一通過檢測區域，這便是所謂的液流聚焦原理

1.2阻抗法 根據庫爾特原理，將不良導體血液按一定比例稀釋于等滲的電解液中，在小孔電極的兩側加一恒流源在負壓作用下，使稀釋的血細胞通過小孔。當細胞通過截面時會由于電阻增大產生相應的脈沖，其脈沖的幅度與細胞的體積成正比，脈沖的頻度與細胞的數量成正比。這便是著名的庫爾特原理或稱變阻脈沖原理。利用庫爾特原理可以有效地區分淋巴及單核細胞。

1.3激光散射法/多角度偏振光散射技術[2] 根據光散射理論，當激光照射到流動室內流過的每一個細胞時，由于細胞的物理特性，部分光線從細胞上經不同的角度散射。其中，前向小角度散射光的光強可以反應細胞體積；大角度散射光的光強可以反應細胞核，漿復雜度和細胞顆粒的信息；而側向散射光的光強可以反應細胞膜、核膜、細胞質的變化。因此，可以依據細胞表明光散射的特點對細胞進行分類。用激光光源產生的單色光束直接進入計數池的敏感區，在不同角度（10°～70°）對每個細胞進行掃描分析，測定其散射光強度，從而提供細胞結構、形態的光散射信息。由于粗顆粒細胞的散射強度比細顆粒細胞更強，故光散射對細胞顆粒的構型和顆粒質量具有很好的區別能力。

多角度偏振散射技術用偏振激光束射照單個排列細胞，并進一步分辨細胞。該技術采用了10°窄角和偏振加消偏振檢測法，分辨能力有所提高。它首先測試中性，單核細胞，用0°～90°的散射數據，再測得90°D的衍射差，將嗜酸性和中性細胞分開而嗜堿性粒細胞、淋巴細胞及單核細胞則按其大小和內部結構不同的復雜性，所產生的散射光也各異，用可調較的門限加以區分。其采用特定程序自動儲存分析數據，并經計算機軟件處理，在屏幕上顯示6個散點圖和2個直方圖。

1.4各種細胞化學特性應用技術 利用五種白細胞自身不同的化學性質應用相應的化學試劑加以區分由于嗜酸性（或嗜堿性）粒細胞均有較強的堿性（或酸性），因此在特殊的溶血劑作用下，經過特定時間及溫度的孵育，可使除嗜酸性（嗜堿性）粒細胞之外的所有細胞溶解或萎縮經處理之后的細胞根據阻抗脈沖計數法，可得相應嗜酸性（嗜堿性）細胞有效數值。

利用五種白細胞過氧化物酶活性的差異對白細胞進行染色，測定其酶反應強度，對白細胞進行分析。血液中五種白細胞的過氧化物酶活性排列順序為：嗜酸性粒細胞>中性粒細胞>單核細胞。淋巴細胞和嗜堿性粒細胞均無過氧化物酶。將待測血液加入清洗劑和甲醛的等滲液體內經孵育，再加入過氧化氫和四氯一萘酚，細胞內過氧化酶分解產生氧離子，使四氯一萘酚顯色并沉淀，并定位于酶反應部位。根據酶反應強度的不同，利用光電檢測技術測定相應吸光度值的方法，用以區分嗜酸性粒細胞、中性粒細胞、單核細胞。

1.5電導，射頻法 與早期的三分類血液分析儀利用庫爾特原理不同的是，它在內外電極上加了一個RF射頻發生器。RF是射頻電流的簡稱它是一種高頻交流變化電磁波。按照工作頻率的不同，RF可以分為低頻（LF）、高頻（HF）、超高頻（UHF）和微波等不同種類不同頻段的RF工作原理不同， 和HF頻段一般采用電磁耦合原理，而UHF及微波頻段的RF一般采用電磁反射原理。在血液分析儀中多采用高頻電磁波，其原理是交變電流通過導體時，會在導體周圍形成交變電磁場，形成電磁波。因導體的密度及導電性質等差異，其周圍所形成的電磁場也不相同。因此當射頻電流穿透細胞膜透入胞內時，由于核的大小、化學組分、顆粒多少以及漿核比例的不同，使RF信號發生不同的變化。借此可以將體積大小相同但內部結構不同的細胞區分開來，如淋巴細胞與嗜堿性細胞。

1.6熒光法 利用不同細胞的細胞膜、胞內因子以及胞內DNA、RNA、胞內離子鈣等不同染色特性，選用具有特異性抗原或抗體的熒光染料載體，使待分離的細胞分別標記相應的熒光物質，經過特定波長的激光照射激發出不同波長的熒光，利用各種PMT管檢測熒光信號的個數，可以完成待檢細胞的計數 如進一步分析計數淋巴細胞或網織紅細胞等

2血細胞五分類技術的現狀及展望

2.1五分類血液分析儀的現狀 全自動五分類血細胞分析儀是多學科相互交叉、滲透、綜合的產物，涉及技術領域包括電子技術、計算機技術、傳感器技術、信號處理技術、生物化學、臨床醫學、精密機械、光學、自動控制、流體力學等領域。絕大多數\"五分類\"分析儀采用了流式細胞分析方法，而聯合檢測法則代表了五分類血細胞分析儀的最新發展趨勢。

由于不同儀器的檢測原理及相關試劑的差異，各類設備均有其相應的特點。總體來講，光學檢測法結合特種化學試劑如染色物質等由于其針對某一被檢物質的特異性，因此其測定及分析結果較電阻法精確度要高，但相應的試劑成本加大，同時對操作人員及環境的要求也會有所提高。

2.2五分類血液分析儀的展望 從五分類血液分析儀的發展進程可以看出，臨床對血細胞的分析已不滿足于簡單的對WBC、RBC、PLT的計數，而是更傾向對于其各類細胞及其亞群的進一步分析，包括從細胞內部的DNA，RNA及免疫等方面進行分析。因此，血細胞分析儀已從對細胞的簡單的物理性能的研究轉向對細胞內部化學性質及免疫性質的研究方向發展，即從細胞學向分子生物學，從分子生物學向免疫學方向發展。同時，隨著工業科技的進步，儀器的精度、速度、集成化、一體化的程度會更高，相信在不久的將來會有更先進的血液分析系統面世。

參考文獻：

[1]明道仁.希森美康SF-3000血液分析儀原理與故障維修[J].中國醫療設備，2010，25（2）：87-88.

[2]龔得朋.XT-18001血液分析儀的原理和日常保養及故障處理[J].中國醫學裝備，2009，15（2）：63-65.編輯/肖慧