電針刺預處理抑制腸缺血再灌注性脾細胞調亡

摘要：目的 研究電針刺預處理抑制腸缺血再灌注大鼠脾細胞凋亡并探討其可能機制。方法 健康SD大鼠32只，隨機分為假手術對照組（S組）、腸缺血再灌注組（IIR組）、電針刺預處理+腸缺血再灌注組（EA + IIR組）和缺血再灌注6 h后電針刺組（IIR6h+EA組）4組。制取脾標本，觀察其組織形態學變化；用免疫組化法檢測脾組織bcl-2，bax和c-fos蛋白表達。結果 Bax和c-fos蛋白的表達在EA+IIR組和IIR6h+ EA組明顯少于IIR組，（P<0.01），其中EA+IIR組的表達又少于IIR6h+ EA組（P<0.01）。Bcl-2蛋白的表達在EA + IIR組和IIR6h+ EA組明顯高于IIR組（P<0.01），其中EA + IIR組的表達又高于IIR6h+ EA組（P>0.05）。Bcl-2/bax比值在EA+IIR組和IIR6h+ EA組顯著高于IIR組（P<0.01），其中EA + IIR組的比值又高于IIR6h+ EA組（P<0.01）。結論 電針刺預處理可以抑制腸缺血再灌注所致的脾細胞凋亡，其機制可能與下調脾臟c-fos、bax蛋白，上調bcl-2蛋白的表達以及通過提升bcl-2/bax比值有關。缺血再灌注前進行電針刺預處理這種抑制作用更明顯。

關鍵詞：電針刺預處理；細胞凋亡；缺血再灌注；脾；腸

腸缺血再灌注損傷（intestine ischemical reperfusion，IIR）是外科常見的病理過程，可引起腸壁組織一系列病理生理改變，并引起遠隔器官的損傷。有研究發現，小腸缺血再灌注后可造成血中氧自由基、脾臟免疫細胞的凋亡基因表達改變[1]。對于IIR后腸壁組織細胞凋亡的抑制有多種方法，包括缺血預處理（i-schemic preconditioning，IPC）和各種化學預處理，但目前對IIR后脾細胞凋亡干預措施的研究少有報道。脾臟在人體中的功能和地位常被忽視，但其在免疫系統中的作用仍值得重視。本研究通過建立大鼠IIR模型，觀察電針刺預處理對脾細胞凋亡的影響并探討其可能機制。

1資料與方法

1.1主要試劑 兔抗大鼠bcl-2、bax和c-fos抗體（購自北京中杉公司生物技術有限公司），兔抗大鼠二抗（美國LI-COR公司），bcl-2、bax和c-fos免疫組化試劑盒，由北京中山生物工程有限公司提供。

1.2試驗動物 Wistar大鼠，雄性清潔級，體重（250±20）g，由哈爾濱醫科大學第二附屬醫院動物試驗中心提供。試驗前適應性飼養1 w，術前12 h禁食，自由飲水。

1.3模型的建立及分組 健康雄性SD大鼠32只，體重（250±20）g，隨機分為假手術對照組（S組）、腸缺血再灌注組（IIR組）、電針刺預處理+腸缺血再灌注組（EA+IIR組）和缺血再灌注6 h后電針刺組（IIR6h+ EA組）4組，每組8只。實驗前禁食12 h，自由飲水，腹腔注射戊巴比妥鈉（30 mg/Kg）麻醉。S組游離腸系膜上動脈（ superior mesenteric artery，SMA） 后不夾閉，5 h后處死；IIR組用無創動脈夾夾閉SMA 1 h后再灌注4 h；EA+IIR組在腸缺血再灌注前給予電針刺，1次/d，30 min/次，共7 d，末次電針后24 h行缺血再灌注術即缺血1h，再灌注4h，余同IIR組；IIR6h+ EA組于缺血再灌注6 h后開始電針刺，操作同EA+IIR組，1次/d，連續7 d。

1.4穴位的選擇 足三里穴屬足陽明胃經，是治療胃腸病的首選穴。電針足三里穴可調整胃腸功能，按照尋經取穴和左右配穴法的原則，本實驗選用足三里來證實電針刺預處理抑制腸缺血再灌注性脾細胞調亡。足三里穴定位：膝關節后外側，在腓骨小頭下約5 mm處。電針方法：選用上海醫用電子儀器廠生產G6805-Ⅱ型電針儀。通電留針30 min，采用連續波，頻率2 Hz，強度以針柄顫動，但能使動物不掙扎嘶叫，保持安靜為度。

2結果

3討論

缺血再灌注損傷的產生因素和發生機制尚未清楚。一般認為，缺血再灌注能夠誘發細胞凋亡或者說細胞凋亡參與了缺血再灌注損傷發生、發展過程，這可能與自由基攻擊、細胞內鈣超載及后者所誘發的細胞因子釋放等多種因素有關。有研究發現小腸缺血再灌注后脾臟免疫細胞的凋亡基因表達明顯改變，其中能誘導凋亡的bax、c-fos和P53在淋巴細胞和巨噬細胞的表達明顯增多，而維持細胞存活的bcl-2表達則很少。

資料表明，c-fos是一種早期反應基因，在缺血再灌注過程中，可在膜信號和Ca2+的介導下，細胞核內c-fos基因轉錄增加，其表達產物可激活多種其它相關基因產生多種生理效應。Bcl-2即細胞凋亡抑制基因，是目前發現的與凋亡關系密切的原癌基因之一，在正常組織自身穩定方面起重要作用。Bax的主要作用是加速細胞凋亡，并與bcl-2一起調節細胞凋亡。細胞內bcl-2/bax比例非常重要，bax占優勢，細胞凋亡，而bcl-2占優勢時，細胞存活。本研究結果顯示IIR組相對于S組bax表達明顯高于bcl-2且bcl-2/bax比值明顯降低。

有研究表明電針刺可以通過調節多種調亡相關基因的表達，阻止腦缺血后脂質過氧化連鎖反應、抑制興奮毒性作用和調節鈣穩態、防止神經細胞內鈣超載等方式產生抗調亡的作用[2]。目前，關于電針刺對抗心腦肝腎等器官缺血再灌注損傷已有報道而對其引起遠隔器官的次級損傷少有報道。基于此，本實驗選擇電針刺對大鼠腸缺血再灌注引起脾細胞的影響為研究對象，并探討其可能機制。劉丹等[3]在研究針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠bcl-2/bax蛋白表達的影響中發現缺血再灌注后6 h，即凋亡早期進行電針刺對凋亡的抑制作用優于缺血再灌注后12 h及24 h，故本試驗選擇缺血再灌注后6 h這個時間點與缺血損傷前電針刺預處理進行比較。

本實驗的研究結果說明，電針刺預處理可以下調脾臟c-fos、bax蛋白并上調bcl-2蛋白的表達以及通過提升bcl-2/bax比值來抑制脾細胞的凋亡，并且，在缺血損傷前進行電針刺預處理的效果明顯優于缺血再灌注后再進行電針刺治療，這可能與電針刺可以下調脾臟c-fos、bax蛋白的表達而相對升高bcl-2/bax比值有關。Bcl-2陽性率在EA + IIR組和IIR6h+ EA組之間比較無差異，還不能證明IIR6h后電針刺可通過升高bcl-2蛋白的表達來抑制脾細胞凋亡。

綜上所述，可以得出這樣的結論：電針刺的抗凋亡作用不僅存在于原發器官缺血再灌注損傷也存在于其引起遠隔器官的次級損傷。尚需對更多組織細胞及凋亡蛋白上游基因的研究來支持這一結論。

參考文獻：

[1]趙佐慶，張志培，陳洪茂，等.犬小腸缺血再灌注后氧自由基改變及脾臟免疫細胞凋亡基因的表達變[J].基礎醫學與臨床，2005，25（3）：244-247.

[2]朱永磊，宋小鴿.針刺對細胞凋亡的影響[J].中醫藥臨床雜志，2007，19（2）：102-104.

[3]劉丹，韓威，張迪，等.不同時間針刺對局灶性腦缺血再灌注大鼠BCL-2/Bax蛋白表達的影響[J].中華中醫藥學刊，2007，25（3）：622-623.

編輯/肖慧