實時熒光定量PCR檢測HBV DNA室內質控分析

摘要：目的 探討實時熒光定量PCR在HBV DNA定量檢測過程中的室內質控問題。 方法 用實時熒光定量PCR法檢測2013年1~7月自制的乙肝陽性室內質控血清，與臨床標本同步檢測，計算每次陽性質控結果的常用對數、標準曲線的斜率、截距和相關系數(r)及相關結果的均值(x)、標準差(s)和變異系數(cv)，利用EXCEL折線散點圖畫出質控圖進行質控。結果 本室 2013年1~7月測定自制的陽性室內質控結果測定值均在控，標準差和變異系數均在允許范圍內，符合要求。結論 本實驗室采用實時熒光定量PCR檢測HBV-DNA定量檢測過程中，選用的質控方法和自制的質控品穩定性良好，能可靠有效地為臨床提供準確的檢驗結果。

關鍵詞：實時熒光定量；聚合酶鏈反應； HBV-DNA；室內質控

Analysis of Real-time Fluorescence Quantitative PCR Detection of HBV DNA Indoor Quality Control

LU Xiao-ling，ZHOU Ming-zhen

(Clinical Laboratory，Wuming County People's Hospital，Wuming 530199，Guangxi，China)

Abstract：ObjectiveTo explore the indoor quality controlproblems in HBV DNA quantitative detection of real-time fluorescence quantitative PCR. Indoor quality control serum HBsAg positive self detection.MethodsFor 1~7 months of 2013 by real-time fluorescence quantitativePCR method and clinical specimens， synchronous detection， curve of standard logarithm， calculated for eachpositive quality control results of the slope， intercept and correlation coefficient (R) value and related results ，standard deviation (s) and the coefficient of variation(CV)， scatter picture quality control chart for quality control by using the EXCEL line. ResultsThe 1~7 months of 2013 were positive results of internal quality control of homemade measured values are in control， the standard deviation and variation coefficient were within the allowable range， meet the requirements. ConclusionThis laboratory detection of HBV-DNA quantitative real-time fluorescence quantitative PCR detection process，quality control methods and quality control of homemadegood stability， can provide valid and reliable accurate test results for clinical.

Key words： Real time fluorescence quantitative PCR; Polymerase chain reaction; HBV-DNA; Quality control

HBV DNA含量是診斷和監測乙型病毒性肝炎的重要指標[1]。目前測定HBV DNA含量的常用方法是實時熒光定量PCR法，想獲得可靠的HBV DNA含量測定結果，必須加強臨床基因擴增檢驗實驗室的質量管理[2]。目前普遍采用Taq-man外標技術對HBV DNA進行熒光定量，但其結果受模板濃度及擴增反應體系的批間差異影響較大。為了探討PCR在HBV DNA定量檢測過程中的室內質控穩定性問題，我們就2013年1~7月用自制的陽性室內質控血清對HBV DNA定量檢測的室內質控數據進行回顧性分析，結果如下。

１ 資料與方法

１.１ 試劑盒購自中山大學達安基因股份有限公司。

１.２ 儀器ABI公司生產的ABI Step One Plus擴增儀。

１.３標本 HBV DNA陽性標本為本院門診和住院的乙型病毒性肝炎患者血清。陽性質控血清采用數量級為106的乙肝患者血清0.1ml與基質血清9.9ml按照1:100的比例混勻作為自制質控血清，各吸取100ul分裝到0.5ml離心管中，-20℃保存備用。

１.4 方法 嚴格按試劑盒說明操作，陽性質控血清使用前充分復溶，每次測定均同時臨床樣本和陽性質控血清進行處理，并加入陰性對照和臨界陽性對照。反應體系為43 ul的擴增反應液和2ul的模板上清液。循環條件的設置為 93℃ 2min；93℃ 45ｓ，55 ℃ 60ｓ，10個循環；93℃ 30ｓ，55℃45ｓ，30個循環。

１.5 擴增結束后，按照儀器操作獲得陽性質控結果以及該次擴增所得到的標準曲線，陽性質控結果轉換為常用對數形式。利用EXCEL的數據統計與圖表功能，根據2013年1~7月的數據來統計陽性質控結果的對數和標準曲線的斜率、截距和相關系數（ｒ）的均值（x）、標準差（ｓ）和變異系數（cv）。在EXCEL單元格中分別輸入2013年1月~7月的陽性質控結果的對數，斜率、截距和相關系數等制作成質控圖，并對其進行分析。

２ 結果

2013年1～7月共進行了89次檢測，89次檢測結果的陰性對照均未出現擴增，陽性質控結果測定值均在控制范圍內，陽性標準品的各參數均在允許范圍內。89次累積數據的分析結果見表1，89次陽性質控結果對數值的部分質控圖見圖1。

圖1部分陽性質控結果對數的質控圖

3 討論

室內質量控制的目的是為了對影響檢驗報告質量的技術、管理、人員、儀器等因素予以有效的控制，保證臨床基因擴增檢驗報告質量符合要求，確保質量體系有效運行。熒光定量PCR室內質控主要涉及檢測標本、所用試劑和檢測結果的質量控制[3]。熒光定量PCR檢測HBV DNA定量過程中，標準曲線對于HBV DNA病毒載量的準確測定是至關重要的，它不僅可以對試劑自身質量如試劑批內批間差異、Taq酶活性實施監控，而且還可對反應液及Taq酶的加入量實施監控[4]。因此，在日常進行實時熒光定量PCR檢測中，可同時用陽性質控的對數結果，標準曲線中的斜率和截距作動態趨勢圖，聯合建立動態監測方法，并以x±３ｓ為失控限，x±２ｓ為警告限進行室內控制。除日常質控外，還應定期評價累積數據以監測在測定操作中的長期變化趨勢。

在2013年1~7月我室所測定的室內質控結果的數據中，有4次的數據非連續超出警告限x±２ｓ。經原因排查，發現有2次是由于更換不同操作者檢測所產生的結果差異，2次確定為ABI Step One Plus儀器孔內的清潔度達不到要求所致的孔間差異，用95%乙醇清潔后室內質控結果達到質量標準。說明PCR檢測結果極易受人員操作、試劑劑量、提取方法等因素影響而導致DNA模板發生丟失、擴增效率降低等，重復性較差。

我們的結果顯示，2013年1~7月我室測定自制的所有室內質控結果均在控制范圍內，沒有超出失控限的點，且標準差和變異系數都較小，在允許范圍內，說明自制的質控品性質穩定，精密度可靠，無需特殊處理便可滿足PCR實驗室HBV DNA檢測室內質量控制的需要。并且由于整個PCR的實驗過程均和待檢標本同步檢測，這樣使得批內重復性和批內精密度都能得到最大限度的保證[5]，從而確保PCR測定過程及結果在偏差和精密度方面達到預定的標準。因為在實際工作中，為了防止假陰性和假陽性的產生，每一批標本在同時檢測4個陽性標準品的同時，另外還做陰性對照和臨界值陽性對照共6個對照品，因而保證了檢測標本結果的準確性。

參考文獻:

［1］ 李金明．感染性疾病免疫測定的室內質量控制[J]．醫學檢驗與臨床，2007，18(1)：3-6．

［2］ 郭向華，黃雁翔，靳海英，等．HBV DNA熒光定量PCR室內質控分析[J]．中國衛生檢驗雜志，2010，20（2）：437－438．

［3］ 黃學忠. 熒光定量PCR室內質控體系的概念及方法[J].國外醫學臨床生物化學與檢驗學分冊， 2005， 26(7): 478.

［4］ 黃學忠，杜笑雅，吳祥．利用標準曲線斜率和截距對HBV DNA熒光定量PCR實施質量監控[J]．臨床檢驗雜志，2004，22（3）：232－233．

［5］ 李美蘭，楊旭，胡瑩．HBV-DNA定量檢測的室內質控分析[J]．海南醫學，2010，21（18）：107－108．編輯/許言