應用cDNA芯片篩選非浸潤性膀胱移行細胞癌差異表達基因

摘要：目的 研究非肌層浸潤性膀胱移行細胞癌( BTCC) 和正常膀胱黏膜上皮差異表達基因。方法 采用高通量cDNA表達譜芯片對3例非浸潤性BTCC及3例正常膀胱黏膜上皮進行檢測，篩選共同表達差異基因。結果 共篩選出274個共同差異基因，其中表達上調2倍以上的基因96個，表達下調2倍以上的基因178個。結論 非浸潤性BTCC癌變是多基因、多途徑、多步驟的復雜過程，高通量的基因芯片技術可以同時定量成千上萬基因表達水平，是一種高效、可靠的強大的技術手段。

關鍵詞：膀胱移行細胞癌；cDNA芯片；基因

膀胱癌是我國泌尿外科臨床中最常見的惡性腫瘤，其中90%以上為膀胱移行細胞癌(bladder transitional cell carcinoma， BTCC)，大部分BTCC患者初次確診時為分化良好或中等分化的非肌層浸潤性膀胱癌，預后較好，但隨腫瘤的分級、分期的升高預后明顯變差[1]。本次實驗采用高通量cDNA芯片檢測非肌層浸潤性BTCC及癌旁正常膀胱黏膜上皮組織的基因表達譜，篩選并分析共同差異表達基因，初步探索非肌層浸潤性BTCC癌變分子機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取甘肅省人民醫院泌尿外科2012年7月～2013年12月手術切除的膀胱移行細胞癌組織標本3例，同期獲取膀胱全切患者正常膀胱黏膜作為對照（均經病理證實） 。將所獲取的新鮮組織樣本，立即在液氮中冷凍并儲存于-80℃備用。3例膀胱癌患者中， 其中男性2例，女性1例，年齡46～71歲，平均57歲，所有患者術前均未做放療、化療。病理分級: G1 2例、G2 1例。TNM分期: T1 3例。

1.2 標本總RNA抽提、純化和質檢按照Trizol試劑 ( Invitrogen公司，US)提供的標準操作流程提取組織塊中的總RNA ， 通過氯仿-異丙醇沉淀法回收，最后用紫外分光光度計檢測樣本A 260/280及總量， 1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。

1.3 芯片雜交、清洗染色及掃描檢測采用Affymetrix公司HG U219表達譜芯片，芯片可檢測約20，000個功能確定、有完整注釋基因的36，000個轉錄本。取上述鑒定合格的總RNA樣本，以Oligo(dT)為引物，反轉錄合成cDNA第一條鏈，以第一條鏈為模板合成雙鏈cDNA。用RNA 擴增試劑盒進行體外轉錄并熒光素標記cRNA，再用RNA 純化試劑盒進一步純化， 之后合成片段化cRNA。片段化的cRNA加入120ul雜交液混合后注入雜交條的樣品孔內，安裝好芯片條，置于45℃雜交儀中，雜交過夜。雜交結束后，將芯片條置于流體工作站進行自動化洗滌和染色步驟。自動清洗染色結束后，再將芯片條放入掃描儀中，關好艙門，進行芯片掃描。

1.4 篩選共同差異基因掃描結束后，GeneAtlas芯片分析系統的芯片分析功能對芯片雜交圖像進行自動分析，獲得基因表達的熒光信號強度值（表達豐度值），對數據進行歸一化處理。然后采用SAM(Significant Analysis of Microarray)軟件倍數差異法，以2倍或以上（Ratio≥2 或≤0.5）差異為標準來篩選非浸潤性BTCC與正常膀胱黏膜上皮的差異表達基因。

2 結果

2.1總RNA抽提質檢結果經測定，所有組織標本抽提的總RNA的A 260/280比值介于1.99-2.08， RNA樣品平均濃度>60 ug/ul；RNA電泳條帶清晰， 28S無明顯降解，28S：18S rRNA條帶亮度接近或略小于2：1，證實總RNA樣品質量合格，符合表達譜芯片實驗要求。

2.2共同差異基因篩選結果采用SAM3.0軟件對掃描后獲得的芯片數據進行分析，以Fold change≥2.0或≤0.5為差異顯著性標準，3對標本共篩選出274個共同差異表達基因，其中表達上調2倍以上的基因97個，表達下調2倍以上的基因有178個。表達顯著增高的基因有AI970337、NM_181799.1、AY217347.1、NM_001080430.2、NM_024762.3等，表達顯著下調的基因有BC057807.1、NM_001299.4、BC039893.1、N52335、D00137.1等。

3討論

膀胱細胞癌變始于細胞DNA改變。癌基因突變、抑癌基因失活，細胞生長、DNA修復、細胞凋亡機制異常等導致膀胱癌發生和進展。p53、FGFR3癌基因突變，被認為是膀胱癌發生兩大通路關鍵因素[2]，Survivin、EGFR過表達對腫瘤侵襲、進展有一定關系[3，4]。基因芯片技術以其高通量、大規模、高效等優點，可以從全基因組水平研究膀胱癌基因表達譜差異， 揭示膀胱癌發生、發展的分子機制，并進一步發掘早期診斷以及復發監測新型腫瘤標記基因。Guo等應用cDNA基因芯片技術和抑制消減雜交技術對膀胱癌尿脫落細胞表達譜進行檢測，建立了可靠地差異基因表達文庫，并驗證端粒酶、HOXA13、IGF-1與膀胱腫瘤相關基因。

本實驗采用可檢測約20，000個功能確定、有完整注釋基因的36，000個轉錄本的表達譜芯片，檢測非浸潤性BTCC和正常膀胱黏膜上皮中基因表達譜。結果顯示，3 例標本中篩選共同差異表達基因274條，其中表達上調96 條，表達下調178條。這些差異基因按其功能主要可以分為以下幾類：原癌基因和抑癌基因、細胞周期調節蛋白、細胞凋亡相關蛋白、細胞信號轉導蛋白、細胞粘附、免疫相關基因、細胞受體、離子結合蛋白、細胞骨架和運動相關蛋白以及一些未知功能基因。基于KEGG數據庫，上調的96個基因中，涉及已知的42 條信號通路，下調的178 個基因，涉及已知的63 條信號通路，其中包括已知直接與膀胱癌相關或與腫瘤發生相關的通路， 如p53 信號通路、Wnt 信號通路、細胞因子-細胞因子受體相互作用、細胞周期通路、細胞凋亡通路、ECM-受體相互作用通路、泛素介導的蛋白質降解通路、Ras 通路、JAK-STAT信號轉導通路、FGFR 信號通路等。這充分證明非浸潤性BTCC的發生是一個多基因改變，涉及多條通路調控的復雜過程，進一步深入研究并這些膀胱癌標志基因及其涉及的信號通路，可以對非浸潤性BTCC發生機制闡明提供可信的依據。

綜上所述， 膀胱癌是多基因改變，涉及多條信號通路調控異常， 從而導致細胞惡性轉化的結果。通過高通量基因芯片對膀胱癌基因表達變化的研究， 高效、系統、大規模地獲取生物內在信息， 可以更好的理解膀胱癌分子機制， 為膀胱癌預防、診斷及基因靶向治療等方面提供新的思路和方法。

參考文獻：

[1]董勝國， 紀祥瑞， 侯四川等. 影響膀胱癌患者長期生存的因素分析[J]. 臨床泌尿外科雜志， 1999. 14.

[2]Lindgren， D.， et al.， Integrated genomic and gene expression profiling identifies two major genomic circuits in urothelial carcinoma[J].PLoS One， 2012. 7(6): e38863.

[3]Srivastava， A.K.， et al.， Diagnostic role of survivin in urinary bladder cancer[J].Asian Pac J Cancer Prev， 2013，14(1): 81-85.

[4]Naik， D.S.， et al.， Epidermal growth factor receptor expression in urinary bladder cancer[J].journal of the Urological Society of India， 2011. 27(2): 208.

編輯/王海靜