先天性心臟病患者Nkx2.5基因突變研究

摘要：目的 對先天性心臟病患者Nkx2.5基因進行突變觀察及關聯研究。方法 分別對50例先天性心臟病病例及50例對照組Nkx2.5基因全部外顯子擴增并測序。結果 在Nkx2.5識別出了1個不改變氨基酸的單核甘酸多態，即c.63A>G多態，但此多態無統計學意義(P>0.05)。結論 Nkx2.5基因的c.63A>G多態可能與CHD有關。

關鍵詞：Nkx2.5；先天性心臟病；基因突變；單核苷酸多態性

先天性心臟病(congenital heart disease，CHD)是一類因胚胎期心血管系統發育異常所引起的先天畸形，也是全世界范圍內最常見的出生缺陷之一，遺傳因素在CHD發病中起重要作用。Nkx2.5是心臟發育及形成的主要相關基因，它的單個或多個基因的突變，均會導致心臟畸形的發生。本研究將從分子水平上對Nkx2.5基因在進行研究和探討，旨在揭示心臟發育相關基因Nkx2.5突變與中國CHD發病的關系，為預防先天性心臟病的發生提供可靠科學依據。

1資料與方法

1.1一般資料2011年1月~6月江西省兒童醫院心臟中心收治的CHD患者共50例，男27例，女23例；包括室問隔缺損(VSD)38例、房間隔缺損(ASD)4例、肺動脈瓣狹窄(Ps)1例、法洛氏四聯征(TOF)1例、復雜CHD6例，均由手術證實。選擇性別、年齡與CHD患者相匹配的正常人50例為對照組，其中男28例，女22例；均經彩色超聲心動圖檢查排除CHD。

1.2基因組DNA制備抽取受檢者外周血2~3ml，采用乙二胺四乙酸（EDTA）鹽抗凝，-80℃保存；使用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒提取外周靜脈血gDNA。

1.3引物設計利用Primer5.0軟件對GenBank數據庫中NKX2.5基因的gDNA序列(登陸號：NT_023133)的外顯子設計引物（引物序列：外顯子1上游引物5'-AAACTGCTCATCGCTCCTGT-3'，下游引物5'-CCTGAGTTTCTTGGGGACG-3'；外顯子2因較大設計兩對引物，分別為2a上游引物5'-GTCAAGCCGCTCTTACCAA-3'，下游引物5'-GGGGCTCTGAACCGCAT-3'，2b上游引物5'-CCGCCGCCAACAACAACT-3'，下游引物5'-GCCGCAAGCTGAAAGAA-3'），引物由上海捷瑞生物工程公司合成。

1.4 PCR擴增及測序50uL PCR反應體系中，取DNA模板4ug、上下游引物各2ug，2×Tap PCR MasterMix 26ul，ddH2O 18ul，采用美國伯樂公司PT-200DNA擴增儀自動擴增。擴增條件：預變性94℃ 3min，變性94℃ 30sec，退火55℃ 30sec，延伸72℃ 1min，30個循環，終延伸72℃ 5min。所有PCR擴增產物均由深圳華大基因公司進行純化及測序。不一致者重新3次PCR擴增后作正、反義鏈測序驗證。

1.5統計學方法采用SPSS13.0統計軟件。分析等位基因及各基因型在CHD患者和正常對照者間的頻率分布，數據比較采用χ2檢驗。P≤0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1識別出一個NKX2.5基因多態在NKX2.5基因中識別出1個不改變氨基酸的單核甘酸多態，即NKX2.5基因編碼序列第63位的腺嘌呤變為鳥嘌呤，相應的第21位的密碼子由GAA變為CAG，但所編碼的氨基酸不變，仍為谷氨酸（glutamic acid，glu），稱為c.63A>G多態(圖1)。

圖1正常對照者和突變攜帶者NKX2.5基因的c．63A>G多態比較

a：為NKX2.5基因c.63A>G純合子A/A的序列；b：為NKX2.5基因c.63A>G雜合子A/G的序列；c：為NKX2.5基因c.63A>G純合子G/G的序列；箭頭為多態位點

2.2NKX2.5基因多態性分析在NKX2.5基因編碼序列第63位點的等位基因G、A及其構成的三種基因型AA、AG、GG在50例CHD患者和50名健康對照者間的頻率分布(χ2=5.483，P=0.064)、等位基因頻率比較(χ2=0.87，P=0.768)，差異無統計學意義。見表1。

3討論

NKX2.5基因又稱為心臟特異性同源盒基因，定位于染色體5q35上，包含兩個外顯子，編碼324個氨基酸，分子量為35ku，兩個外顯子之間有1.5Kb的內含子，在進化中高度保守。NKX2.5基因由N端的TN結構域、中部的同源結構域和C端的NK2特異性結構域3部分構成，其中外顯子2上有一個含有60個(138～197位)高度保守氨基酸組成的同源結構域，其三維結構是由3個a-螺旋組成，螺旋II和III形成一個螺旋一轉角一螺旋結構，NKX2.5通過螺旋III與目的基因中特異性的DNA序列5'-T(C／T)AAGTG-3'結合，從而調節下游基因的轉錄活性。一旦同源結構域發生突變，就會直接導致突變蛋白與DNA的結合活性下降，引起心臟畸形[1-3]。

本研究對NKx2.5基因進行突變研究，未發現任何突變，但識別出1個單核甘酸多態，即c.63A>G多態，此多態在正常對照組和實驗組皆有發現，且不改變氨基酸并差異無統計學意義。此結果與石琳[4]等發現c.63A>G多態在VSD、TOF組有統計學意義及韓增強[5]等研究提示此多態在ASD組有統計學意義結果不一致，考慮原因可能是由于樣本量少及地域性差異所致。此同義突變雖不改變氨基酸表達，但由于位于編碼區，可能對NKX2.5mRNA的剪接、穩定性造成影響，從而影響蛋白質量的表達導致先天性心臟病。此觀點可通過擴散樣本量及轉錄水平的研究進一步證實。因此，Nkx2.5基因的c.63A>G多態可能與CHD有關。

參考文獻：

[1]Raffin M，Leong L M，Rones M S，et al．Subdibivision of the cardiac Nkx2.5 expression domain into myogenic and nonmyogenic compartments[J].Dev Biol，2000，218(2)：326-340.

[2]Reamon-Buettner SM，Borlak J.NKX2-5: an update on this hypermutable homeodomain protein and its role in human congenital heart disease (CHD)[J].Hum Mutat，2010，31(11):1185-1194.

[3]Akazawa H，Komuro I.Cardiac transcription factor Csx/Nkx2-5:Its role in cardiac development and diseases[J].Pharmacol Ther，2005，107(2):252-268.

[4]石琳，申阿東，李曉峰，等.中國先天性心臟病Nkx2．5基因突變篩查及關聯研究[J].首都醫科大學學報，2005，26(5):525-527.

[5]韓增強，唐胤，陳彧，等.81例單純性先天性心臟病患者Nkx2.5基因突變篩查及關聯研究[J].中國循環雜志，2011，26(6):461-464.編輯/哈濤