缺血性腦損傷的分子機制及中藥干預研究進展

摘要：缺血性腦血管病是臨床常見的一大類中樞神經系統的疾病，缺血引起的腦損傷目前認為與興奮性氨基酸毒性作用、炎癥反應、凋亡等多種因素密切相關，但其具體機制還不明確，導致缺乏針對性的治療。本文擬通過對腦缺血發病機制的探討以及中藥干預的機制從而為腦缺血性疾病的治療提供新的治療思路。

關鍵詞：腦缺血；機制；中藥

The Molecular Mechanism of Cerebral Injury after Ischemia and the Application of Traditional Chinese Medicine during the Treatment of Cerebral Ischemia

SHI Yong-mei1，SU Hao2，LIAO Jun1，LI Xin-hua2

(1.Department of Anatomy，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China;2.School of Combine Traditional Chinese and Western Medicine，Hunan University of Traditional Chinese Medicine，Changsha 410208，Hunan，China)

Abstract：Nowadays， Studies show that toxity of exciting amino acids，inflammatoryreaction，apoptosis are involved in the development of cerebral injury after ischemia. However the exact mechanisms of cerebral injury after ischemia is still unclear. At the same time Traditional Chinese Medicine is more and more used in the treatment of cerebral ischemia. It is necessary to investigate the injury mechanism after cerebral ischemia and the Traditional Chinese Medicine application.

Key words：Cerebral ischemia;Mechanism;Traditional Chinese Medicine

腦血管疾病是威脅人類健康的重大疾病之一，具有高死亡率，高發病率和高并發癥發生率的特點。腦血管疾病中約70%為缺血性腦血管病又被稱為缺血性腦卒中或缺血性腦中風，隨著人們生活水平的提高和社會競爭的日益激烈，腦血管病的發病率呈不斷增高的趨勢，腦血管疾病已成為我國人口的第二大死亡原因，所以受到政府和學界的廣泛關注。因此研究缺血性腦損傷的分子機制及中藥的干預治療具有重要的意義。

目前缺血腦損傷的分子機制及中藥干預的實驗研究主要集中在以下幾個方面：①興奮性毒性作用；②鈣超載;③圍梗死區去極化；④炎癥反應；⑤氧化應激和硝化應激(自由基)；⑥凋亡。

1 興奮性毒性作用

即興奮性氨基酸的毒性作用。體內的興奮性氨基酸（EAA）包括谷氨酸、天冬氨酸和甘氨酸 ，抑制性氨基酸主要是γ-氨基丁酸，其中腦內的興奮性氨基酸主要是谷氨酸、天冬氨酸。腦的重量只占體重的2%，其耗氧量卻占到了全身供氧量的80%，而腦所消耗的氧通過氧化磷酸化產生足夠的ATP以維持離子梯度，約有70%的氧用于維持細胞膜上Na+-K+-ATP（鈉泵）的功能。研究表明，腦缺血時線粒體ATP合成受抑制，從而使鈉泵失靈， 神經元胞膜去極化，鈉內流，鉀外流，誘發鈣內流，從而導致鈣超載。同時神經元胞膜去極化還可引起EAA的釋放，其中最主要的就是谷氨酸的釋放。突觸內谷氨酸濃度的升高引發NMDA 和AMPA兩種谷氨酸受體的激活。受體通道的開放引起更廣泛的細胞膜去極化和鈣內流，加劇細胞內鈣離子超載。研究發現廣泛性前腦缺血主要導致海馬CA1區的錐體細胞發生興奮性細胞毒性損傷，使用NMDA受體拮抗劑可以阻止這種損傷，減少細胞死亡。強制性的共同激動劑甘氨酸位點拮抗劑內源性犬尿喹啉酸對海馬CA1區的錐體細胞具有保護作用[1]。

與興奮性毒性并發的酸中毒加劇了鈣超載，腦缺血引起乳酸堆積，pH值下降，激活酸敏感性鈣離子通道（ASIC），導致更多的鈣內流，此時具有促進鈣內流作用胞膜鈉鈣轉運體NCX（有三種亞型，腦缺血時發揮作用的主要是NCX-1)不足以將多余的鈣排出胞外，從而導致嚴重鈣超載并最終導缺血神經元的結構和功能的破壞[2]。Na+/H+ 轉換體-1抑制劑可以通過抑制線粒體鈣超載保護腦缺血后由于興奮性氨基酸增多導致的神經元損傷。

同時科學家發現在缺血性腦中風的動物模型中，谷氨酸等興奮性氨基酸濃度的升高除了可以激活NMDA和AMPA兩種谷氨酸受體之外，還可以作用于G-蛋白偶聯受體即Ⅱ型代謝性谷氨酸受體（mGluRs），從而導致腦內小角質細胞釋放TNF-α從而對中樞神經元產生毒性作用。另外，EAA的增多刺激AMPA、KA和mGluRs，介導鈉離子內流，引起細胞水腫。EAA還可以激活蛋白激酶C進而作用于內質網IP3受體，介導鈣離子從內質網釋放，加劇胞內的鈣超載。腦缺血后使用組胺H3受體拮抗劑可以通過減少鈣離子內流，增加抑制性遞質γ－氨基丁酸（GABA）釋放GABA對神經元興奮性毒性有減輕作用），從而逆轉NMDA誘發的神經元損傷。

最近的研究發現補陽還五湯的稀釋液尤其是高劑量使用時可以減少大腦中動脈結扎導致的缺血再灌注損傷時腦脊液中興奮性氨基酸的含量，增加抑制性氨基酸GABA（γ-氨基丁酸）的含量從而減小缺血梗死面積和改善行為學評分，發揮腦保護作用[3]。銀杏內酯B可以抑制興奮性氨基酸的毒性作用[4]。

2 鈣超載

缺血缺氧﹑氧化應激及細胞膜毒性物質﹑興奮性氨基酸等均可誘發細胞內鈣超載。在正常情況下細胞內膜系統上有許多跟鈣離子調控密切相關的蛋白質，即鈣通道。這些蛋白質位于細胞膜或細胞器膜上，可以允許細胞外鈣離子順著濃度梯度進入細胞內，即鈣內流，也可以幫助細胞器中的儲存鈣釋放至細胞漿，即內鈣釋放；膜系統上同時存在鈣外流的通道如Na+/Ca2+轉運體，二者共同維持鈣的分布平衡。鈣內流通道包括NMDA依賴性和非依賴性兩種。酸敏感性鈣通道（ASICs)和瞬時膜電位離子通道(TRPM7)以及Na+/H+ 轉換體-1是重要的非NMDA依賴性的鈣內流通道。腦缺血時胞外鈣內流導致的胞內Ca2+濃度急劇升高通過磷脂酶C水解二磷酸肌醇產生的三磷酸肌醇激活肌質網上IP3R通道，激活的IP3R通道將Ca2+從肌質網釋放至胞漿內，從而導致胞內鈣超載，而同時內質網膜和線粒體膜上鈣ATP酶（SERCA）可將Ca2+從胞漿泵回到肌質網內，降低胞漿Ca2+ 濃度。腦缺血發生后線粒體內也同時出現了鈣的大量積聚，從而引起線粒體膜內膜滲透性改變，通透性轉換孔（MPTP）開放，許多大分子非選擇性地由胞漿向線粒體擴散，導致線粒體膜電位的破壞和功能障礙。Ca2+也可與MPTP相結合，導致線粒體腫脹，功能失調，甚至引起細胞死亡。同時Ca2+激活Ca2+依賴的磷脂酶，能引起膜磷脂的分解，在分解過程中產生游離脂肪酸、前列腺素、白三烯、溶血磷脂等，均對細胞產生毒害作用。鈣超載被認為是眾多因素導致細胞損傷的最后共同通路。

3圍梗死去極化

皮質擴散性抑郁（CSD）是在正常腦組織皮質中存在的自我傳播的電化學活動。CSD引起持續的細胞膜去極化，增加谷氨酸釋放，降低膜離子梯度。圍梗死去極化是自發的去極化電波，在局灶性腦缺血繼發的缺血半暗帶中存在CSD的傳播.相關研究表明，局灶性腦缺血后不僅缺血中心區和缺血半暗帶的神經元出現損傷甚至遠隔缺血區也發生多種基因表達的改變和神經元變性，有學者認為也與CSD的播散有關.Chang 等發現在CSD發生的不同階段同時伴隨著神經血管反應并最終導致神經元缺血缺氧[5]。

4 炎癥反應

Tetracycline可以通過降低Beclin 1和LC3(兩種自噬標記物)的表達和抑制小膠質細胞的激活從而抑制自噬作用，同時調控NF-κB信號通路減少腫瘤壞死因子α(TNF-α)和白介素6(IL-6)的表達從而抑制腦缺血后的炎癥反應[6]。

4.1細胞炎癥反應腦缺血后中性粒細胞在血管內的聚集阻塞微循環，阻礙再灌后的腦血流恢復。實驗發現中性粒細胞主要通過趨化因子IL-8及其受體CXCR1/2的作用遷移到病變部位從而導致局部的炎癥反應[7]。同時中性粒細胞釋放氧自由基和蛋白分解酶而損傷神經元和膠質細胞，造成腦水腫并增加顱內壓。小膠質細胞的激活和單核細胞的浸潤也會激發炎癥及細胞毒性反應。此外激活的淋巴細胞參與腦缺血后血腦屏障的破壞，腦缺血后血腦屏障完整性的標志物腦啡肽原高表達可預示神經功能損傷和恢復程度[8]。缺血后使用Propofol進行處理，可通過上調bFGF的表達減少梗死面積，減輕腦水腫[9]。新近的研究表明， 腦缺血后缺血局部和集募集到病變部位的小膠質細胞和巨噬細胞表型均從健康的M2型向病變的M1型轉變，導致腦細胞損傷的發生[10]腦缺血后神經元釋放組胺增加可以通過H2受體抑制腦缺血后中性粒細胞、小膠質細胞和T 淋巴細胞的浸潤抑制炎癥反應。大腦中動脈結扎制備腦缺血模型實驗中發現術后使用銀杏內酯B可降低缺血后血腦屏障的通透性減輕腦水腫，減小梗死面積[11]。使用氧糖剝奪模型建立腦缺血模型的實驗中發現黃芩苷可以通過上調緊密連接蛋白claudin-5 和 ZO-1的表達從而降低缺血后升高的血腦屏障的通透性[12]。杜仲可以在大腦中動脈栓塞導致的腦缺血實驗中通過TLR通路抑制小膠質細胞的激活[13]。

4．2細胞因子炎癥反應 缺血時內皮細胞、小膠質細胞和神經元等都可以釋放細胞因子如IL-1，IL-6，TNF-ɑ，TNF-β和趨化因子如CNC、MCP-1 等[14]。Rodríguez JA等通過研究發現血清中基質金屬蛋白酶前體和TNF-ɑ檢測水平與腦缺血損傷的嚴重程度成正比[15]。另外腦缺血后，神經元釋放組胺增加，可以抑制TNF-α、IAM-1等因子的產生，從而對抗炎癥反應。腦缺血缺氧的實驗中發現腦缺血后COX-2和IL-1β表達上調，在應用前列腺素干預后表達可下降。CH可以通過抑制NF-ΚB的激活減少iNOS， GFAP的表達，從而減輕大腦中動脈栓塞后神經元的丟失，減少梗死面積，改善缺血導致的功能缺陷[16]。

實驗研究表明蒺藜皂苷(GSTT)可減少因大腦中動脈栓塞后腦梗死的面積，水腫體積及神經行為的異常，這種作用可能與增加NF-ΚB的表達并進一步抑制TNF-ɑ，IL-1β有關[17]。研究發現冬蟲夏草對于腦缺血具有神經保護作用，其機制可能是通過抑制TNF-α、IL-1β.ICAM-1、VCAM-1等炎癥因子的表達，減少其在腦組織中的含量，從而起到一定的抗炎效應而產生腦保護作用。人參皂甙Rd能夠減少LPS激活的小膠質細胞的數量和體積，抑制小膠質細胞分泌IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-ɑ、IFN-γ、CXCL1從而減輕炎性反應。黃芩甙抑制腦缺血后iNOS mRNA， COX-2 mRNA的表達發揮抗炎癥反應作用[18]。腦缺血再灌注損傷后丹參酮IIA tanshinone IIA能夠下調神經元巨噬細胞遷移抑制因子（MIF）的表達進而抑制巨噬細胞的激活，同時抑制NF-κB 減少TNF-αandIL-6的表達[19]。川芎嗪通過上調神經元及巨噬細胞/小膠質細胞Nrf2/HO-1的表達進而抑制炎癥因子的表達對腦缺血發揮保護作用[20]。

5氧化應激和硝化應激

細胞內高濃度的鈣和鈉能引起線粒體產生有害的反應活性氧。過多的氧自由基能引起細胞內大分子的破壞（如DNA損傷標志物8-羥基-2'-脫氧鳥嘌呤的大量表達）和參與細胞內的信號轉導機制，誘發凋亡[21]。同時缺血增加NO的合成和過氧化亞硝酸鹽的產生。自由基能激活機制金屬蛋白酶，降解膠原和層粘連蛋白從而破壞血管壁增加血腦屏障的通透性。氧化應激和硝化應激還能引發白細胞向腦血管的聚集和遷移，進一步加劇血腦屏障的破壞并最終導致腦水腫和炎癥細胞的浸潤。缺血－再灌注過程中，大量活性氧自由基釋放引起氧化應激，而氧化應激可誘導自噬的激活。低劑量的酒精能夠促進腦缺血后細胞核內過氧化增殖體激活的受體(PPARγ)的表達從而減輕DNA腦缺血后神經元DNA的損傷和減少細胞凋亡，提示抗氧化是對腦缺血有保護作用的[22]。同時有科學家指出哺乳動物去乙酰化酶在對抗腦缺血引起的氧化應激中可能發揮一定作用[23]。在大鼠大腦中動脈結扎后使用黃芪的提取物毛蕊異黃酮苷能夠降低MDA和ROS的表達，同時SOD和GSH-Px表達增加從而抑制氧化應激反應達到保護腦缺血再灌損傷的目的[24]。中藥參歸可以明顯升高腦缺血后腦組織中SOD的活性并降低MDA的含量從而在腦缺血發揮抗氧化作用[25]。銀杏內酯B可以降低腦缺血后活性氧化物和MDA的表達[26]。永久性前腦缺血后使用丹參酮IIA不僅可以增強SOD的活性同時還可以抑制MDA的表達[27]。人參皂甙Rd抑制腦缺血后自由基的表達。杜仲皮提取物之一梔子苷通過核因子E2相關因子(Nrf2)抑制腦缺血引發的氧化應激反應[28]。

6 凋亡

腦缺血后，熱休克蛋白HSP70表達水平上調，從而使得雙特異性磷酸酶M3/6(DUSP8)水平升高，JNK失活，有利于HSP70發揮促進錯誤蛋白正確折疊的作用[29]。但最終在多因素的作用下，神經元結構和功能逐步喪失。腦缺血引起的細胞死亡有三種形式：凋亡，自噬性細胞死亡和壞死。［三者之間存在復雜的聯系。輕度的缺血損傷更容易引發一種類似凋亡途徑的細胞死亡，而不是壞死。尤其是對于缺血半暗帶的神經元來說，因為側枝循環的存在，ATP供應正常，凋亡的發生率較高。能引發凋亡的因素包括氧自由基，死亡配體，DNA損傷，蛋白酶的激活和鈣超載。最新研究發現甲狀腺素T3能夠通過上調Bcl-2的表達來抑制慢性腦缺血(兩血管結扎模型)引起的海馬神經元的凋亡[30]。

最近研究發現功能缺陷的調節T細胞(Tregs)作為一種內源性的免疫調節劑，可以保護大腦中動脈栓塞引起的腦缺血，其機制可能與減少缺血后MMP-9的表達從而減輕血腦屏障的破壞，減輕腦內炎癥和炎癥細胞向缺血腦區的聚集有關[31]。MiR-424可以通過抑制小膠質細胞G1/S期的轉換從而抑制小膠質細胞激活同時減少梗死面積和細胞的凋亡[32]。

以往的研究表明細胞凋亡有線粒體依賴的和非線粒體依賴(死亡受體途徑即TNF-α和Fas作為配體)的兩種。早期實驗發現線粒體依賴的神經元凋亡信號途徑有胞內鈣離子信號系統，CAMP/PKA信號系統，酪氨酸蛋白激酶(PTK)信號系統及二酰甘油/蛋白激酶C信號途徑等。激活的AKt和MAPK與凋亡基因Bax，Bad，糖原合成激酶3，凋亡信號調節激酶-1及caspase 9相互作用，抑制它們的活性從而抑制細胞凋亡，腦缺血后AKt活性降低進而導致其抗凋亡的作用減弱. 最新研究表明線粒體C-JUN 氨基末端激酶（JNK）的激活是缺血導致腦損傷的關鍵環節，抑制其激活可以減少ATP的丟失和抑制脂質過氧化從而保護線粒體的完整性進而抑制細胞凋亡。使用JNK MAPK（分裂原活化蛋白激酶）的抑制劑可以抑制C-JUN磷酸化及激活子蛋白（AP-1)的活性及腦內細胞因子及趨化因子的表達[33]。使用降糖藥羅西格列酮是一種合成型的過氧化物酶體增殖激活受體γ (PPARγ)的拮抗劑，它上調雙特異性磷酸酶8(DUSP8)并抑制缺血引起的JNK的磷酸化，保護短暫性前腦缺血引起的腦損傷[34]。另外線粒體凋亡誘導因子AIF參與了caspase依賴的內源性細胞死亡途徑， 自噬作用參與了細胞死亡途徑[35]。在各種不同的腦缺血模型中G-CSF均可以抑制神經元的凋亡[36]。

腦栓通能顯著改善腦缺血損傷大鼠的神經功能缺損，減少缺血灶周邊星形膠質細胞、腦血管內皮細胞和神經元的凋亡。腦栓通通過保護腦缺血再灌注后大鼠的神經血管單元促進神經功能的改善。腦缺血后黃芩甙分解caspase3或者通過抑制COX-2的表達從而抗神經元凋亡[37]。燈盞花素在腦缺血后通過抑制鈣超載及抑制caspase3和上調bcl-2的表達發揮抗凋亡作用[38]。

7 NO

研究表明，腦缺血缺氧損傷后腦內NOS的表達顯著增加[39]。誘導性NOS減小梗死面積保護腦缺血，而內皮細胞源性NOS導致損傷加重.而同時NOS和NADPH氧化酶導致活性氧自由基生成增多.血管緊張素二受體阻滯劑通過PI3-K/Akt通路促進eNOS的磷酸化減少腦缺血后的梗死面積，改善神經行為學評分，從而對腦血管病發揮保護作用[40]。實驗發現電刺激缺血缺氧幼鼠后大腦皮質內NO的表達明顯上調而nNOS/NO比例下降，進而促進幼鼠運動功能的恢復[41]。永久性前腦缺血后丹參酮IIA可以降低NO的含量及iNOS的表達。人參皂甙Rg1在氧糖剝奪缺血模型中可以抑制nNOS的活性減少NO的形成B保護缺血神經元。

另外自噬性細胞死亡也是目前腦缺血損傷機制研究的一個熱點。自噬( autophagy) 是細胞受到刺激后，通過溶酶體途徑降解細胞內物質的統稱，廣泛存在于真核細胞中，主要負責長半衰期蛋白及細胞器的降解和再利用，以電鏡下出現大量雙層膜結構的自噬體為特征。自噬是細胞在營養缺乏時的一種適應性反應，自噬不適時發生或過度激活，可引起不同于細胞凋亡的另一種程序性細胞死亡-自噬性細胞死亡。有研究發現，細胞在受到外界因素刺激或在細胞內部應激情況下，均可誘導自噬的發生。氧化應激，內質網應激和興奮性氨基酸毒性都是誘發應激的重要因素。以往的實驗研究發現，用NMDA處理海馬切片后可引起神經細胞死亡，而在死亡的神經細胞中出現了大量的自噬體;表明NMDA可引起自噬性細胞死亡。

在腦缺血治療中不同的藥物例如中黃芩甙 梔子苷和熊去氧膽酸作用途徑不同，然而它們在疾病發病，細胞和分子功能及生理功能方面都有不同程度的疊加。在腦缺血治療中黃芩甙 梔子苷作用途徑有60%的相似性，同時使用兩種藥物可產生不同單獨用藥的藥效[42]。另外復方藥物如清開靈注射液在腦缺血后使用可以發揮抗炎癥 保護血腦屏障及保護血管等多種作用，提示復方藥物的作用途徑遠遠超出我們的理解[43]。

腦缺血性疾病的發病是多因素作用的結果，其發病過程和發病機制非常復雜。目前的研究還缺乏系統性。因此，在未來針對腦缺血的發病機制研究還需要考慮各個因素之間的相互作用，具有多作用靶點的中藥復方將發揮愈來愈重要的角色。

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編輯/王海靜