腸桿菌科細菌產(chǎn)碳青霉烯酶研究進展

摘要：碳青霉烯類抗生素是抗菌譜最廣、抗菌活性最強的非典型β內(nèi)酰胺類抗生素， 因其對β內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定以及毒性低等特點， 已經(jīng)成為治療多重耐藥菌感染最主要的抗菌藥物之一，尤其適用于治療由產(chǎn)超光譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和\\或AmpC酶細菌所引起的嚴重感染。既往臨床實驗室分離的耐碳青霉烯類抗生素菌株多為假單胞菌和不動桿菌等非發(fā)酵菌。但隨著碳青霉烯類藥物的廣泛使用，耐碳青霉烯類抗生素的泛耐藥腸桿菌科細菌的出現(xiàn)也越來越多。

關(guān)鍵詞：腸桿菌科細菌；碳青霉烯酶；耐藥機制；改良Hodge試驗；PCR；同源性

由于腸桿菌科細菌是臨床上重要的醫(yī)院感染菌之一，對碳青霉烯類抗菌藥物的耐藥的泛耐藥腸桿菌科細菌的流行給臨床抗感染治療帶來了極大困難。引起腸桿菌科細菌對碳青霉烯類的耐藥機制主要有高產(chǎn)AmpC酶合并膜孔蛋白缺失、產(chǎn)生了水解碳青霉烯類藥物的碳青霉烯酶、青霉素結(jié)合蛋白(PBP)的改變、主動外排系統(tǒng)的活躍。其中碳青霉烯酶的產(chǎn)生是泛耐藥菌對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因。碳青霉烯酶是能夠明顯水解碳青霉烯類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，現(xiàn)階段，已知的碳青霉烯酶主要包括以下四種，即Ambler分子分類A-D類。其中A、D類均屬于絲氨酸酶，屬于Bush分群中的第2f和2d亞組，B類主要由金屬酶過程，屬于bush分群中的第3a組。在腸桿菌科細菌中的碳青霉烯酶主要是A類酶和B類酶， 到目前為止，依據(jù)臨床實驗室耐藥菌株的監(jiān)測數(shù)據(jù)和文獻報道，以KPC酶最為多見，在我國，以上海、浙江等地發(fā)現(xiàn)較早、較多，并且出現(xiàn)了發(fā)生局部性的流行的趨勢。D類酶（OXA），在腸桿菌科細菌中極為少見，主要由不動桿菌屬中檢出。碳青霉烯酶編碼基因的具有較高的應(yīng)用價值，它不僅能夠確定對基因元件中的移動質(zhì)粒進行固定，發(fā)揮其在菌種的傳播作用，還能夠在染色體的輔助下， 控制細菌間的傳播[1，8]。

1碳青霉烯酶的分類

1.1 A類碳青霉烯酶A類碳青霉烯酶為絲氨酸酶，其中含有絲氨酸結(jié)構(gòu)，屬于Bush分群中的第2f亞組，這類酶都是青霉素酶，他們對亞胺培南的水解活性進行分析時，發(fā)現(xiàn)他明顯強于美羅培南，且還能促使青霉素類、碳青霉烯類等藥物產(chǎn)生耐藥性作用，而對第3代頭孢菌素通常敏感。他唑巴坦、克拉維酸能夠降低此類的活性，但不被乙二胺四乙酸(EDTA)所抑制。不水解第3代頭孢菌素。其中由質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC酶易于在不同菌種中傳播，已成為腸桿菌科細菌耐碳青霉烯類抗生素的主要原因之一。

自2001年在美國北卡羅來納州肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)由質(zhì)粒介導(dǎo)的碳青霉烯酶KPC-l[1]，2004年紐約州質(zhì)粒介導(dǎo)的KPC-3肺炎克雷伯菌引起的醫(yī)院感染之后[2]。KPC類碳青霉烯酶在全球的檢出率逐年升高，美國的紐約州和新澤西州曾一度出現(xiàn)產(chǎn)KPC類碳青霉烯酶耐藥菌株的流行[3，4]。2004年浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院首次在臨床分離到了產(chǎn)KPC-2酶的肺炎克雷伯菌之后[5]，在我國上海、浙江等地也曾報道了KPC類碳青霉烯酶個別亞型的局部流行。KPC類碳青霉烯酶主要為質(zhì)粒介導(dǎo)，頭孢菌素類、碳青霉烯類以及氨曲南等抗生素會出現(xiàn)水解作用，且克拉維酸會明顯降低KPC酶的活性[1]。相關(guān)研究顯示，在肺炎克雷伯菌中并未檢測出KPC酶的存在，但是在腸桿菌科中其他菌種中均可檢測出不同數(shù)量的KPC酶的各種亞型，包括: 肺炎克雷伯菌的KPC-2[6]、KPC-3（質(zhì)粒介導(dǎo)）、肺炎克雷伯菌GES-4（Ⅰ類整合子介導(dǎo)）[7]、陰溝腸桿菌NMC-A[8]和IMI-1[9]、粘質(zhì)沙雷菌SME-1、SME-2、SME-3[10]、大腸埃希菌GES-3等。目前國內(nèi)外研究已發(fā)現(xiàn)10種KPC亞型[1，2，6]（KPC-1～KPC10），其中KPC-2檢出率最高。

1.2 B類碳青霉烯酶B類碳青霉烯酶為金屬酶，屬于Bush分群中的第3a組。其活性位點有Zn2+，其催化活性依賴Zn2+，因此又稱為金屬β一內(nèi)酰瞎酶。其水解底物包括青霉素婁、頭孢菌素類和碳青霉烯類抗生素，對安曲南類則不會產(chǎn)生水解作用，表現(xiàn)為產(chǎn)酶菌株對臨床常用抗菌藥物的廣泛耐藥。受到EDTA等金屬螯合劑的影響，加入Zn2+后能重新促使其發(fā)展，此時受他唑巴坦、舒巴坦的影響較小，相反受大多數(shù)由整合子等對其的影響會明顯增大[11]。近年來，在腸桿菌科細菌，如大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌等菌種中也有發(fā)現(xiàn)。

1.3 D類碳青霉烯酶D類碳青霉烯酶主要流行于不動桿菌屬中，其在不動桿菌屬中的亞型也已多達60多種。但是D 類碳青霉烯酶在腸桿菌科細菌中卻極少被發(fā)現(xiàn)和報道，目前在腸桿菌科中發(fā)現(xiàn)的D類碳青霉烯酶為來自肺炎克雷伯菌的OXA-48[10]，其對亞胺培南有較高的水解活性，與其他OXA類碳青霉烯酶的同源性僅為46%。

2碳青霉烯酶的檢測方法

臨床試驗室常用的檢測產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌的篩選方法有改良Hodge試驗（MHT）、金屬酶的EDTA檢測方法，這兩種檢測方法有簡便、易操作、易判讀結(jié)果的優(yōu)點。依據(jù)2009年版CLSI建議，對MIC增高或紙片法抑菌圈縮小的碳青霉烯類抗生素敏感腸桿菌科細菌，采用改良Hodge試驗（MHT）檢測碳青霉烯酶，這一檢測方式的敏感度和特異度均≥90%。改良Hodge試驗（MHT）檢測方法為：在無菌生理鹽水中準備0.5麥氏標準濁度的大腸埃希菌ATCC25922（指示菌），用無菌生理鹽水稀釋10倍，按常規(guī)藥敏實驗度將該細菌接種至直徑為90mm的MH平板，在常溫下放置5min左右，并將美羅培南藥敏紙片（10ug）置入平板中心位置。于平板上取20mm的縱向切口，并在無菌接種環(huán)的輔助下提取血板中的待測菌，并接種中介的菌株。于35℃恒溫下孵育20h，并對細菌接種情況進行觀察，若劃線與抑菌圈交叉位置的細菌呈失狀增強生長（典型為蘋果蒂樣生長）則提示檢查結(jié)果為陽性，否則為陰性。有文獻報道，用厄他培南作為實驗底物時改良Hodge試驗（MHT）的敏感性大于90％；用亞胺培南和美羅培南作為實驗底物，其敏感性均較低，但亞胺培南和美羅培南作為實驗底物時的特異性比厄他培南高[19]。由于不同種類碳青霉烯酶對藥物的水解作用有所差異，所以針對不同種類碳青霉烯酶的檢測也有不同的側(cè)重點。例如：KPC酶對超廣譜頭孢菌素有水解作用，因此對頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢噻肟等頭孢類抗生素耐藥的菌株應(yīng)注意檢測KPC酶；改良Hodge試驗（MHT）所檢測的菌株為底表達金屬酶菌株時，靈敏度會降低，會出現(xiàn)假陰性結(jié)果。此時，可采用Lee等的Hodge試驗（MHT）改進方法[16]，即在藥敏紙片上添加10ul50mmol/L的ZnSO4或在MH平板中加入ZnSO4使最終濃度達到70ug/ml，由于Zn2+存在可以提高金屬酶的活性，此時改良Hodge試驗（MHT）的敏感性和特異性均＞95。

金屬酶的檢測，Lee等報道指出，抑制劑增效實驗是行金屬酶檢測的有效方式之一[6]。進行實驗操作期間可先將0.5mmol/LEDTA鈉鹽溶液注入亞胺培南紙片（每片中加入EDTA約為750ug），并對其紙片進行分析，比對加入EDTA情況對抑菌圈的影響，并根據(jù)其檢查結(jié)果來判斷待測菌株是否產(chǎn)生金屬酶，如果加EDTA后抑菌圈直徑增大7mm及以上時判定為產(chǎn)金屬酶。

3產(chǎn)碳青霉烯酶腸桿菌科細菌感染的治療

臨床研究表明，產(chǎn)碳青霉烯酶細菌的耐藥性具有復(fù)雜性的特點，且該菌株還會產(chǎn)生AmpC酶、ESBLs，并與其他耐藥機制相互影響，如外膜通透性增加、藥物作用位點改變、主動外排系統(tǒng)的活躍等，使得臨床抗菌藥物的選擇更加困難。目前，當人們感染該類細菌時，臨床并無治療該感染的特效藥物，用藥治療期間，往往先對患者的細菌耐藥性進行分析，再確定治療方案。必要時采用抗生素的聯(lián)合應(yīng)用。去除感染危險因素，盡量減少對患者的侵襲性操作。及時撥出導(dǎo)管、引流管等。

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編輯/申磊