oxHDL3對人臍靜脈內皮細胞t—PAmRNA表達的影響

摘要：目的 探討oxHDL3對人臍靜脈內皮細胞株HUVEC-12細胞組織型纖溶酶原激活物（tissue type plasminogen activator，t-PA）表達的影響。方法 HUVEC-12細胞分別經不同濃度（0、20、40、80 mg/L）HDL3、oxHDL3孵育，采用RT-PCR的方法檢測t-PAmRNA表達情況。結果 與0mg/L oxHDL3組比較，oxHDL3呈劑量依賴性下調t-PA mRNA的表達，以80 mg/L oxHDL3濃度組減少最明顯，較0mg/LoxHDL3組下降了30%（P<0.05）。結論 oxHDL3呈劑量依賴性下調人臍靜脈內皮細胞t-PA mRNA的表達。

關鍵詞：t-PA；HDL3；oxHDL3；動脈粥樣硬化

中圖分類號：R183.4 文獻標志碼：A

動脈粥樣硬化病變發生的原因和發病機制一直是醫學領域內的重要研究課題。已有的證據表明，動脈粥樣硬化與脂蛋白代謝密切相關。Nakajima等在人腹主動脈粥樣硬化斑塊內膜處用oxHDL 特異抗體9F5-3a檢測到oxHDL的存在，并定位在主動脈內皮細胞，清道夫受體SR-B1 和 LOX-1是其受體[1]。最近有文獻證實，oxHDL及亞型oxHDL2、oxHDL3通過激活p38MAPK上調TF的表達[2]，此外，oxHDL及其亞型還可通過減少內皮細胞TFPI-1分泌[3]，減弱對TF的抑制作用，干擾體內抗凝/促凝平衡，從而促進As血栓的形成。這提示oxHDL在As發生發展中起重要作用。本文通過觀察oxHDL3對人臍靜脈內皮細胞株HUVEC-12細胞表達t-PA mRNA的影響，為闡明oxHDL在動脈粥樣硬化發生發展過程中的作用提供新的實驗依據。

1資料與方法

1.1一般資料 HUVEC-12細胞株來源于中南大學湘雅醫學院細胞中心，RPMI-1640培養基為Gibco產品；谷氨酰胺、丙酮酸鈉、胰蛋白酶和EDTA為Sigma產品；胎牛血清為杭州四季清產品。通用RT-PCR試劑盒購自北京博大泰克生物公司。健康人血漿購自衡陽市血站。

1.2方法

1.2.1 HDL3和oxHDL3的制備和鑒定 HDL3的制備：采用密度梯度超速離心的方法分離健康人血漿中的HDL（1.063～1.21 g/mL）、HDL2（1.063～1.125 g/mL）、HDL3（1.125～1.21 g/mL）；oxHDL3的制備：HDL3于4℃用PBS透析24 h后。1 mg/mL HDL3在37℃與含20 μmol/L CuSO4的PBS溶液孵育24 h。4℃，用含0.1% EDTA的PBS透析24 h，換液1次/8 h。BCA法蛋白定量，過濾除菌，4℃避光保存。HDL3和oxHDL3的鑒定：將HDL3和oxHDL3分別進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳，oxHDL3電泳遷移率明顯快于HDL3表明已經被氧化修飾。

1.2.2細胞培養 HUVEC-12貼壁生長于10%小牛血清RPMI-1640基礎培養液中，培養液中含1%丙酮酸鈉、1%谷氨酰胺、100 IU青霉素和鏈霉素，在37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。每次實驗前24 h換新鮮培養基后加處理因素。

1.2.3細胞總RNA提取和逆轉錄-聚合酶鏈反應 收集細胞，總RNA提取試劑提取總RNA。根據之前研究[3]，t-PA引物序列上游：5-GAGCCAAGGTGTTTCAACG-3，下游5-CCCATTCCCAAAGTAGCAG-3，PCR擴增產物長度399 bp；內參照采用GAPGH，引物序列上游5-TCACCATCTTCCAGGAGCGAG-3，下游5-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAG-3，PCR擴增長度為697 bp。PCR反應條件：94℃下5 min預變性，94℃下30 s變性，58℃下30 s退火，72℃下45 s延伸，35個循環，72℃ 10 min繼續延伸。反應結束后，取RT-PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠電泳中電泳。

1.2.4統計學處理 實驗所得數據均為均數±標準差（x±s），組間采用方差分析及t檢驗，由SPSS 11.0統計軟件完成，P<0.05為差異具有顯著性。

2結果

2.1 HDL3氧化修飾前后鑒定 瓊脂糖凝膠電泳顯示，見圖1，HDL3成一條帶。經20 μmol/L CuSO4孵育20 h后，由于陰離子含量增多，oxHDL3電泳遷移率明顯快于天然的HDL3，表明已被氧化修飾。

2.2 oxHDL3對HUVEC-12細胞t-PAmRNA表達的影響 分別用不同濃度的HDL3、oxHDL3（0 mg/L，20 mg/L，40 mg/L，80 mg/L）孵育HUVEC-12 24 h后，用RT-PCR方法檢測各組t-PA mRNA 的水平，見圖2。結果顯示，與0 mg/L oxHDL3組相比，20 mg/L、40 mg/L，80 mg/L oxHDL3濃度組細胞t-PAmRNA的表達均有所減少，以80 mg/L濃度組減少最明顯，較0 mg/L oxHDL3組下降了30%（P<0.05）。不同濃度的HDL3對HUVEC-12細胞t-PA mRNA表達的影響不明顯，差異無統計學意義。表明oxHDL3可下調HUVEC-12 細胞t-PAmRNA的表達。

3討論

本研究發現HDL氧化修飾后在動脈粥樣硬化的發生發展過程中發揮了重要作用。此外，我們還發現，oxHDL2，oxHDL3這兩種亞型在動脈粥樣硬化的發生發展過程中的作用有所差異。值得注意的是本研究發現oxHDL3顯著下調HUVEC-12細胞t-PA的表達。這表明，oxHDL3在動脈粥樣硬化的發生發展過程中可能發揮了更為重要的作用。最近有文獻報道[4]，小而密HDL具有較強的抗氧化活性和抗炎作用，而小而密HDL主要為HDL3，提示此種類型的HDL的修飾改變將導致更嚴重的后果。這也進一步證明了oxHDL3的致動脈粥樣硬化病理效應可能強于其他類型的氧化HDL。因此，進一步闡明oxHDL3參與動脈粥樣硬化形成的病理生理作用和機制，為預防和控制動脈粥樣硬化性疾病提供幫助顯得尤為重要。

參考文獻：

[1]Nakajima T， Matsunaga T， Kawai S， Hokari S， Inoue I， Katayama S， Nagata A， Komoda T. Characterization of the epitopes specific for the monoclonal antibody 9F5-3a and quantification of oxidized HDL in human plasma[J].Ann Clin Biochem， 2004，41（4）：309-315.

[2]卜梓斌，姜志勝，馬珍妮，等.氧化高密度脂蛋白通過MAPKs信號轉導途徑誘導ECV304細胞表達組織因子[J].中國病理生理雜志，2009，25：636-641.

[3]彭湘萍，姜志勝，任重，等.高密度脂蛋白及其亞型氧化修飾后對人臍靜脈內皮細胞損傷及TFPI-1表達的影響[J].中國動脈硬化雜志，2009，17：588-589 .

[4]Cutuli L，Pirillo A，Uboldi P， Kuehn H，Catapano AL.15-lipoxygenase-mediated modification of HDL3 impairs eNOS activation in human endothelial cells. Lipids. 2014，49（4）：317-26.

編輯/張燕