E3泛素連接酶HECTD3真核表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

摘要：目的 鑒定E3泛素連接酶 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3，HECTD3） 基因的真核表達(dá)質(zhì)粒。方法 提取無(wú)內(nèi)毒素真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000將其轉(zhuǎn)染進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3細(xì)胞，qRT-PCR法和蛋白質(zhì)免疫印跡技術(shù)檢測(cè)該基因的表達(dá)情況。結(jié)果 真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HECTD3可以顯著地提高HECTD3基因在mRNA和蛋白水平的表達(dá)量。結(jié)論 HECTD3基因的真核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功，可以用于后續(xù)卵巢癌發(fā)生發(fā)展的分子生物學(xué)研究。

關(guān)鍵詞：E3泛素連接酶；卵巢癌；真核表達(dá)質(zhì)粒

卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，僅2011年1年就導(dǎo)致全世界140000人死亡[1]。HECTD3 （homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3）是一個(gè)功能目前尚未闡述清楚的新的E3泛素連接酶[2]。有報(bào)道指出該基因可能在乳腺癌和宮頸癌中介導(dǎo)順鉑的化療耐受[3]，但尚未有人報(bào)道HECTD3在卵巢癌中的作用。實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建該基因真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HECTD3，本研究將鑒定該真核表達(dá)質(zhì)粒在胞內(nèi)對(duì)HECTD3基因表達(dá)情況的影響，為進(jìn)一步研究HECTD3基因在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用提供有力的工具和手段。

1實(shí)驗(yàn)材料

卵巢癌細(xì)胞SKOV-3和真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HECTD3由本室保存。Trizol、Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)invitrogen公司，RPMI-1640、胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒cDNA Synthesis Kit （M-MLV Version）、SYBR○RPremix Ex Taq II（Ti RNaseH Plus）購(gòu)自TaKaRa公司。Endo-free Plasmid Extraction Kit II購(gòu)自omega公司，細(xì)胞裂解液購(gòu)自碧云天，蛋白酶抑制劑cocktail購(gòu)自Roche公司。Anti-HECTD3鼠多抗、anti-β-actin鼠單抗、辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的鼠二抗購(gòu)自abcam公司，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自millipore公司。引物由invitrogen公司合成。

2實(shí)驗(yàn)方法

2.1 qRT-PCR 提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000將其轉(zhuǎn)染進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3，24 h后提取細(xì)胞總RNA，并將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，此為qRT-PCR模板。內(nèi)參Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase （GAPDH）上游引物序列：5'-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTGA-3'，下游引物：5'- TTCTCCATGGTGGTGAAGACGCCA-3'；HECTD3的上游引物：5'- CAGGCAGGTCTGCTGAAGGT-3'，下游引物：5'-CGAGTCAGATGGCTCGAAGT

C-3'。qRT-PCR反應(yīng)體系如下：SYBR 10 μL，F(xiàn)orward Primer 0.8 μL，Reverse Primer 0.8 μL，ROX Reference Dye II 0.4 μL，DNA模板 100 ng，用雙蒸水補(bǔ)至20 μL體積。qRT-PCR反應(yīng)條件如下：95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s（40個(gè)循環(huán)）40℃ 1 min。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，用SPSS 19.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.2蛋白質(zhì)免疫印跡 提取無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒pcDNA-HECTD3，利用lipofectamine 2000將其轉(zhuǎn)染進(jìn)卵巢癌細(xì)胞SKOV-3，48 h后提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，置于5% 脫脂奶粉中室溫封閉2 h，室溫孵育一抗2 h （HECTD3，1∶500；β-actin，1∶5000），TBST洗3次×15 min，分別加入辣根過(guò)氧化酶偶聯(lián)的鼠二抗（1∶10000），室溫孵育1 h，TBST洗3次×15 min，化學(xué)發(fā)光試劑盒ECL顯色。

3實(shí)驗(yàn)結(jié)果

利用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)HECTD3在卵巢癌細(xì)胞中的mRNA水平的表達(dá)情況，見(jiàn)圖A。由圖可以看出，轉(zhuǎn)染了表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-HECTD3的細(xì)胞中HECTD3在mRNA水平的表達(dá)量是對(duì)照組的3.489倍，且P<0.01。同時(shí)采用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)HECTD3蛋白在兩種細(xì)胞中的表達(dá)量變化，見(jiàn)圖B。可以看出，轉(zhuǎn)染了pcDNA-HECTD3質(zhì)粒的細(xì)胞中HECTD3蛋白表達(dá)豐度較對(duì)照組明顯提高。由此說(shuō)明，我們成功構(gòu)建了HECTD3基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，且將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)卵巢癌SKOV-3細(xì)胞之后能夠在mRNA水平和蛋白水平顯著地提高該基因的表達(dá)豐度。

HECTD3在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)情況（A）將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SKOV-3中，24 h后檢測(cè)HECTD3基因在mRNA水平的表達(dá)情況，**表示P<0.01。（B）將質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SKOV-3中，48 h后檢測(cè)HECTD3蛋白水平的表達(dá)情況。

4討論

利用酵母雙雜交技術(shù)Yu J等人發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的E3泛素連接酶HECTD3基因[4]。有學(xué)者通過(guò)免疫共沉淀技術(shù)發(fā)現(xiàn)HECTD3可能參與了神經(jīng)元的發(fā) 育[5]。Li Y等報(bào)道在乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞中抑制E3泛素連接酶HECTD3表達(dá)后能促使癌細(xì)胞對(duì)順鉑增敏[3]。目前尚未有在卵巢癌中研究HECTD3基因功能的報(bào)道，因此本研究首先在體外卵巢癌細(xì)胞中驗(yàn)證了該基因真核表達(dá)的情況。在后續(xù)的研究中，我們將構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)HECTD3基因的SKOV-3細(xì)胞系，同時(shí)深入探討體外過(guò)表達(dá)該基因所引起的一些列細(xì)胞學(xué)變化及其具體的分子機(jī)制。

參考文獻(xiàn)：

[1]Jemal A，Bray F，Center M M， et al.Global cancer statistics[J].CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69-90.

[2]Mattern M R， Wu J， Nicholson B.Ubiquitin-based anticancer therapy： carpet bombing with proteasome inhibitors vs surgical strikes with E1， E2， E3， or DUB inhibitors[J].Biochim Biophys Acta，2012，1823（11）：2014-2021.

[3]Li Y， Chen X， Wang Z，et al.The HECTD3 E3 ubiquitin ligase suppresses cisplatin-induced apoptosis via stabilizing MALT1[J].Neoplasia，2013，15（1）：39-48.

[4]Yu J， Lan J， Zhu Y， et al. The E3 ubiquitin ligase HECTD3 regulates ubiquitination and degradation of Tara[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，367（4）：805-812.

[5]Zhang L， Kang L， Bond W， et al.Interaction between syntaxin 8 and HECTd3， a HECT domain ligase[J]. Cell Mol Neurobiol，2009，29（1）：115-121.

編輯/肖慧