22種化合物對(duì)幽門螺桿菌體外抗菌活性的研究

摘要：目的 篩檢22種化合物對(duì)幽門螺桿菌（Helicobacter pylori）標(biāo)準(zhǔn)菌株、臨床耐藥菌株的最低抑菌濃度（MIC），對(duì)臨床化合物成藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。方法 采用瓊脂稀釋法檢測22種化合物對(duì)Hp標(biāo)準(zhǔn)菌株（ATCC700392，NCTC11637）和臨床耐藥菌株（耐阿莫西林1 μg/mL，耐甲硝唑64 μg/mL，耐克拉霉素0.25 μg/mL）的MIC值。結(jié)果 化合物W9、J2、J5、J1O對(duì)5株Hp的MIC值均>32 μg/mL，化合物J11的MIC值為32 μg/mL，化合物J3、J4、J6、J7-J9的MIC值均為16 μg/mL，化合物W8的MIC值為8 μg/mL，化合物W5-W7、W10、W11的MIC值均為4 μg/mL，化合物GM1'、GM2'、GM3'的MIC值均為0.5 μg/mL，化合物GM1的MIC值為0.125 μg/mL。結(jié)論 GM1對(duì)Hp的抗菌活性最好，MIC值為0.125 μg/mL；抗菌活性次之的化合物是GM1'、GM2'、GM3'，MIC值為0.5 μg/mL；其余化合物對(duì)Hp均有不同程度的抗菌活性。

關(guān)鍵詞：幽門螺桿菌；化合物；抗菌活性

幽門螺桿菌是一種定植于胃黏膜表面與黏膜層之間的革蘭氏陰性微需氧菌，在正常人群中的感染率極高，以每年0.5%～1%的速度遞增[1]，我國Hp的感染率已高達(dá)42%～90%，是Hp的高感染區(qū)之一[2]，大量研究顯示Hp不僅與人類慢性活動(dòng)性胃炎、消化性潰瘍、胃癌、胃淋巴樣組織淋巴瘤等消化系統(tǒng)疾病相關(guān)[3-5]。國際上目前推薦一線治療方案是同時(shí)服用質(zhì)子泵抑制劑加兩種抗生素的三聯(lián)療法[6]。但Hp對(duì)抗生素的耐藥率不斷上升[7]。為探索治療Hp的新藥，本次實(shí)驗(yàn)應(yīng)用化學(xué)藥物結(jié)構(gòu)改造后形成的22種化合物，采用瓊脂稀釋法測定Hp標(biāo)準(zhǔn)株、臨床耐藥株的MIC值，為臨床化合物成藥提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1資料與方法

1.1一般資料

1.1.1菌株來源 HpNCTC11637由貴陽醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室周建獎(jiǎng)教授惠贈(zèng)。HpATCC700392購置于ATCC；臨床耐阿莫西林株、耐甲硝唑株、耐克拉霉素株由貴陽醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)教研室提供。

1.1.2化合物 22種化合物由浙江麗水學(xué)院藥物研究所汪冶博士提供。一類化合物以3-氨基-N-甲基苯甲酰胺原料，經(jīng)酰胺化反應(yīng)合成了N-（3-甲基氨基甲酰基苯基）-芳香乙酰胺類化合物，編號(hào)為W5-W11；第二類化合物以間溴苯胺為原料，經(jīng)酰胺化反應(yīng)合成了N-間溴苯基-芳香乙酰胺類化合物，編號(hào)為J1-J11；第三類化合物分別以萘乙酸、吲哚乙酸、扁桃酸為原料，經(jīng)酰胺化反應(yīng)合成了3-氨基-N-甲基苯甲酰胺類化合物，編號(hào)為GM1、GM1'、GM2'、GM3'。

1.2方法

1.2.1配制傳代平板及細(xì)菌培養(yǎng) 稱取哥倫比亞血瓊脂粉加雙蒸水，高壓滅菌后，待瓊脂冷卻至50℃～55℃時(shí)加入10%無菌脫纖維羊血、1%混合抗生素充分混充，傾倒于無菌平皿中，冷卻后4℃?zhèn)溆谩?fù)蘇待測的5株菌株，穩(wěn)定培養(yǎng)觀察細(xì)菌生長情況并對(duì)Hp鑒定：革蘭氏染色、氧化酶、觸酶、尿素酶試驗(yàn)。將革蘭氏染色為陰性，生化鑒定試驗(yàn)均為陽性的細(xì)菌傳代培養(yǎng)。

1.2.2配制含藥平板 首先配制溶劑對(duì)照平板：取DMSO含量分別為0.5、1、1.5、2 mL的溶劑對(duì)照平板，經(jīng)觀察得出，在DMOS含量為1 mL時(shí)5種菌均生長良好，因此得出溶解化合物的DMSO量為1 mL。根據(jù)化合物的量配制化合物濃度梯度分別為32 μg/mL、16 μg/mL、8 μg/mL、4 μg/mL、2 μg/mL、1 μg/mL、0.5 μg/mL、0.25 μg/mL、0.125 μg/mL。

1.2.3藥敏實(shí)驗(yàn) 將ATCC700392、NCTC11637、耐阿莫西林株、耐甲硝唑株、耐克拉霉素株分別制備菌懸液，將其涂布于含不同濃度的藥平板上，三氣培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)72 h后，肉眼觀察結(jié)果。

1.2.4 MIC判斷 將平板置于暗色、無反光物體表面肉眼觀察，在含22種化合物瓊脂平板上肉眼看不到細(xì)菌生長對(duì)應(yīng)的藥液最低濃度為其MIC值。

2結(jié)果

3討論

幽門螺桿菌治療研究中還存在諸問題，目前要根除Hp仍很困難，根除失敗的主要原因是對(duì)抗生素產(chǎn)生的耐藥性。目前三聯(lián)或四聯(lián)療法是最常用的方案，但聯(lián)合的抗生素越多，副作用發(fā)生的頻率越高，經(jīng)費(fèi)開支也越大。目前的研究表明[8]：Hp對(duì)常用抗生素的耐藥率正逐漸上升，其中對(duì)甲硝唑的耐藥率是導(dǎo)致根除失敗的重要原因。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于新藥合成或?qū)σ阎衔锝Y(jié)構(gòu)進(jìn)行改造得到新的藥物的研究越來越全面，抗生素的藥理作用已遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出最初的作用。目前合成新藥的設(shè)計(jì)主要是兩方面，①是根據(jù)已知藥物，進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)改造；②是從生化作用的機(jī)制出發(fā)，合成嶄新的類型。已知藥物的結(jié)構(gòu)改造正在不斷導(dǎo)致作用優(yōu)越的新藥。尤其是要真正符合安全、綠色和高效的現(xiàn)代化學(xué)合成的理念。

在本次實(shí)驗(yàn)中采用22種化合物對(duì)Hp的MIC值進(jìn)行篩檢，不僅選用了兩株Hp的標(biāo)準(zhǔn)株作為互相對(duì)照，還選用了三株臨床耐藥株（耐阿莫西林1 μg/mL，耐甲硝唑64 μg/mL，耐克拉霉素0.25 μg/mL）。實(shí)驗(yàn)采用的方法為瓊脂稀釋法結(jié)果表明：GM1對(duì)Hp的MIC值最小，為0.125 μg/mL，其抑菌效果最為明顯；其次該系列的化合物GM1'、GM2'、GM3'對(duì)Hp的MIC值為0.5 μg/ml，說明該化合物對(duì)Hp的抑菌效果也很明顯。由于阿莫西林、甲硝唑、克拉霉素是治療Hp感染的一線常用藥物，因此本次實(shí)驗(yàn)所選取的這三株臨床耐藥株對(duì)22種化合物的篩檢更有重要的臨床意義，其結(jié)果對(duì)今后這22種化合物的成藥提供了堅(jiān)實(shí)的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉巍，姜黎，胡興壽，等.幽門螺桿菌相關(guān)性疾病及其防治[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2007，189（10）：1563-1565.

[2]胡伏蓮.幽門螺桿菌感染診療指南[J].北京：人民衛(wèi)生出版社，2006.

[3]Marshall BJ，Warren JR，Unidentified curved bacilli in the stomach of patients with gastritis and peptic ulceration [J].The Lancet ，1984，1（16）：1311-1315.

[4]Correa P. Helicobacter pylori infection and Gastric cancer [J].Cancer epidemiol bimarkers prevention.2003，12：129-137.

[5]Peek RM Jr，Blaser MJ. Helicobacter pylori and gastrointestinal tract adenocarcinomas [J] . Nat Rev Cancer， 2002，2：28-37.

[6]Chuah SK， Tsay FW， Hsu PI et al. A new look at anti-Helicobacter pylori therapy [J]. World Journal of Gastroenterology，2011，17（35）：3971-3975.

[7]成虹，胡伏蓮，謝勇，等.中國幽門螺桿菌耐藥狀況以及對(duì)耐藥對(duì)治療的影響--全國多中心臨床研究[J].胃腸病學(xué)，2007，12（9）：525-530.

[8]胡伏蓮.幽門螺桿菌感染治療中的問題及處理策略[J].中國中西醫(yī)志，2010，30（3）：229-232.

編輯/肖慧