高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測薯蕷皂甙元

朱小燕，雷新榮，嚴春杰，沈 翔

（1.中國地質(zhì)大學(xué)（武漢）材料與化學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074；

2.中國地質(zhì)大學(xué)（武漢）納米礦物材料及應(yīng)用教育部工程研究中心，湖北 武漢 430074）

薯蕷皂甙元（diosgenin），商品名為薯蕷皂素，簡稱皂素，分子式C27H42O3，分子結(jié)構(gòu)式見圖1，化學(xué)名△5－異螺旋甾烯－3β－醇，屬異螺旋甾烯烷的衍生物，為薯蕷科薯蕷屬植物根莖中薯蕷皂甙的水解產(chǎn)物［1］。

它以糖甙的形式廣泛存在于自然界的植物中，尤以薯蕷科含量最多。世界各國生產(chǎn)的甾體激素60%以上用它為原料。甾體激素應(yīng)用廣泛，目前，大約有400多種藥物以薯蕷皂素為生產(chǎn)原料或中間體［2］。我國薯蕷皂素年產(chǎn)量4 000t以上，占全球產(chǎn)量的90%，其中2／3用于直接出口［3］。利用黃姜生產(chǎn)薯蕷皂甙元的制備方法包括酸水解法、物理分離法、自法和超聲發(fā)酵法、酶水解法、超臨界流體萃取法等［4］。

1 薯蕷皂甙元檢測方法簡述

當(dāng)前薯蕷皂素價格約95萬元／噸［3］。測試方法的不同及結(jié)果的偏差都會帶來貿(mào)易的糾紛。因此，具體工作中選擇何種方法檢測是一個需要考慮的問題。國內(nèi)外報道的薯蕷皂甙元檢測方法早有重量法［5］、薄層比色法［6］、紫外分光光度法［7］、旋光法［8］、紅外光譜結(jié)合核磁共振的方法［9］、薄層掃描法［10］、氣相色譜法（GC）［11］、高效液相色譜法（HPLC）［12］等。2002 年陜西省依據(jù)此發(fā)布《黃姜薯蕷皂素》DB61／T 302—2002的地方標準，該標準即以皂素熔點的高低作為判斷黃姜皂素合格與否、優(yōu)質(zhì)與否的重要判斷依據(jù)。但缺點是時間長，易造成觀測誤差，儀器造成的系統(tǒng)誤差較大，人為因素較多，產(chǎn)生了定性不準的缺點［13］。

圖1 皂素分子結(jié)構(gòu)

高效液相色譜法測定薯蕷皂甙元含量不需要進行分離，也不需要進行衍生化，減少了檢測操作步驟，且測試更快更準，被越來越廣泛地應(yīng)用于薯蕷皂素的檢測［4］。對薯蕷皂甙元檢測分析的研究目前多采用此法，采用正相或反相色譜法，二者均采用末端吸收波長進行檢測［14］。早期多采用正相色譜法，現(xiàn)在反相色譜法應(yīng)用最為廣泛（約占HPLC分離分析的70%～80%［15］），因為反相色譜法在近紫外區(qū)透明度較好，背景吸收相對較低。但，如果樣品在紫外光區(qū)的吸收信號太弱，流動相對其影響較明顯。

蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）可用來測定那些不能用紫外檢測器、熒光檢測器檢測的組分，消除了常見于傳統(tǒng)HPLC檢測方法中的難點，它的響應(yīng)不依賴樣品的光學(xué)特性，任何揮發(fā)性低于流動相的樣品均能被檢測，不受其官能團的影響。因此，本文嘗試建立薯蕷皂甙元的HPLC－ELSD分析方法，并將此方法與已有文獻中所用的高效液相色譜法作對比，使學(xué)生更深入地理解HPLC測試及數(shù)據(jù)處理的方式方法。本文所采用方法快速、方便、準確度高，也適合于用戶的測試需求。

2 實驗

2.1 主要實驗儀器和試劑

儀器：Dionex p680液相色譜儀；AllTECH 蒸發(fā)光散射檢測器ELSD2000。

試劑：HPLC分析用甲醇為色譜純；HPLC分析用水（18.2MΩ·cm，總有機碳量為3mg／L）由 Millipore純水機制備；皂素標樣購自于北京恒元啟天化工技術(shù)研究院；其他化學(xué)試劑均為分析純，一般用水為去離子水；薯蕷皂甙元產(chǎn)品利用環(huán)保酸浸法從黃姜中提取獲得［16］，制得薯蕷皂甙元含量不同的3個樣品記為Sample1、Sample2、Sample3。

2.2 實驗方法

2.2.1 標準溶液的配制

準確稱取皂素200mg用色譜級甲醇溶于10mL容量瓶中，作為母液；從母液中移取0.5、1、1.5、2mL溶于10mL容量瓶中定容，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾，測試。

2.2.2 樣品溶液配制

稱 取 Sample1、Sample2、Sample3 3 種 樣 品 各0.02g定容于10mL容量瓶中，利用乙醇溶解；從10 mL中分別取1mL定容于10mL容量瓶中，甲醇定容，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過濾。用Dionex p680液相色譜儀和AllTECH蒸發(fā)光散射檢測器ELSD2000進行測試。

2.2.3 HPLC－ELSD分析條件

色譜柱：ZORBAX SB－C18（4.6mm×150mm，5μm），柱溫28℃，進樣量10μL。

流動相：V（水）／V（乙腈）＝1 090（等梯度）。

ELSD：氣 流 流 速 1.2mL／min，漂 移 管 溫 度80℃。

2.2.4 常規(guī)HPLC方法對比測試

樣品制成0.5g／L溶液與標樣（對照品）注入液相色譜儀檢測含量。采用文獻［13］的檢測條件：流動相：V（甲醇）∶V（水）＝84∶16，流速為1.0mL／min；進樣量為20μL；檢出波長為210nm［13］。檢測柱：C18反相柱。儀器為Agilent1220型高效液相色譜儀。

3 結(jié)果與討論

3.1 流動相的選擇

選用V（甲醇）∶V（水）＝95∶5［17］，V（甲醇）∶V（水）∶V（乙腈＝30∶20∶50）［18］，V（乙腈）∶V（水）＝90∶10［19］，V（石油醚）∶V（異丙醇）＝98∶2［20］為流動相進行比較。結(jié)果表明：水和甲醇的流動相中，溶劑甲醇有較大的背景吸收，因此靈敏度較低；采用10%水和90%乙腈等梯度洗脫程序時，峰形對稱性好，分析效果最為理想。

3.2 工作曲線

按2.2.3節(jié)的HPLC條件，分別將質(zhì)量濃度配制成0.1、0.2、0.3、0.4g／L的標準溶液系列樣品進樣。每個濃度平均測試5次，以皂素的峰面積為縱坐標，以皂素的質(zhì)量濃度為橫坐標繪制工作曲線（見圖2），得到線性方程y＝138.5x－3.280，R2為0.996，y為面積，x為標樣質(zhì)量濃度，R為相關(guān)系數(shù)。

圖2 薯蕷皂素工作曲線

3.3 樣品的 HPLC－ELSD測試

按2.2.2節(jié)方法制備樣品溶液，并按2.2.3節(jié)方法測定。色譜圖見圖3，測定結(jié)果表明，3個樣品中薯蕷皂甙元的含量（質(zhì)量分數(shù)）如表1所示。5次測定值的相對標準偏差為1.2%。

圖3 樣品Sample1、Sample2、Sample3的 HPLC－ELSD色譜圖

表1 樣品的HPLC－ELSD的測試

3.4 樣品的HPLC對比測試及其存在的問題

按2.2.4節(jié)的 HPLC條件，分別將標準樣品（STANDARD SAMPLE）按質(zhì)量濃度配制成0.1、0.2、0.3、0.4g／L的標準溶液系列樣品進樣。通常，學(xué)生所得數(shù)據(jù)無法得到較好的擬合標準曲線。于是，學(xué)生將標樣及3種樣品都配制成0.2g／L進行直接測試，得到圖譜見圖4。并且，按文獻［21］所提供的公式計算：

其中，cx供測試品的質(zhì)量濃度，cR對照品的質(zhì)量濃度，Ax供測試品的峰面積，AR對照品的峰面積，mR對照品質(zhì)量，mx供測試品質(zhì)量。

按式（2）計算得到的Sample1、Sample2和Sample3薯蕷皂甙元的質(zhì)量分數(shù)分別為36.65%，28.81%和21.84%。與HPLC－ELSD方法所測的結(jié)果相差太大。主要原因是：①樣品在210nm處紫外吸收太弱，數(shù)據(jù)信號不強；②計算公式（2）不可以直接應(yīng)用，因為，峰面積與含量之間對應(yīng)并不是1∶1的關(guān)系，而是以一定系數(shù)的線性方程所得。因此，利用HPLC測試皂素的數(shù)據(jù)在實際應(yīng)用中存在著較大的問題，而利用HPLC－ELSD測試ELSD的優(yōu)勢得到體現(xiàn)。

4 結(jié)論

本文建立了黃姜皂素產(chǎn)品中皂素測定的高效液相色譜－蒸發(fā)光散射檢測方法，消除了樣品紫外吸收弱的影響，提高了定量的準確性。通過對比測試，讓學(xué)生理解了HPLC測試過程及數(shù)據(jù)處理中應(yīng)該注意的問題。而且該方法操作簡便，省去了固相萃取步驟，縮短了檢測周期，也可滿足實際檢測工作的需要。

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圖4 樣品Sample1、Sample2、Sample3及STANDARD SAMPLE的HPLC色譜圖

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