祛風勝濕顆粒提取工藝優選

秦海軍，張 毅，馬 玲，陳師農，任燕茹

（1.安徽省藥物研究所，安徽 合肥230022；2.安徽省中藥研究與開發重點實驗室，安徽 合肥230022；3.安徽中醫藥大學藥學院，安徽 合肥230031）

中藥復方祛風勝濕顆粒是根據著名經方“羌活勝濕湯”研制而成，處方中含有羌活、獨活、防風、川芎、藁本、蔓荊子和炙甘草7味藥，主治風濕在表、肩背痛不可回顧、頭痛身重、腰脊疼痛、難以轉側、苔白脈浮。方中以羌活、獨活為君，羌活入太陽經，能祛上部風濕，獨活善祛下部風濕，二者相合，能散周身風濕，舒利關節而痛痹；以防風、藁本為臣，祛太陽經風濕，且止頭痛；佐以川芎活血，祛風止痛；蔓荊子祛風止痛；佐以甘草調和諸藥。綜合全方，共成祛風勝濕之功，服后當微發其汗，使風濕盡去，其痛即止。本研究中將方中羌活、獨活進行醇提，考察了醇提時不同加醇量、回流時間、回流次數對浸膏得率及異歐前胡素含量的影響；防風等藥材采用單因素試驗，考察了加水量、提油時間對揮發油量的影響；將甘草與醇提藥渣及提油藥渣進行水提，考察了水提時不同加水量、煎煮時間、煎煮次數對浸膏得率及甘草酸單銨鹽含量的影響，得出了祛風勝濕顆粒穩定可行的提取工藝。現報道如下。

1 儀器與試藥

LC－10ATvp型高效液相色譜儀（單元泵，SPD－10Avp檢測器，LC－色譜工作站）；天津奧特塞斯AT－130型柱溫箱；AR1140型電子天平。異歐前胡素對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110827－201109，含量測定用）；甘草酸單銨鹽對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110731－201116，含量測定用）；甲醇、乙腈為色譜純），水為重蒸水，其他試劑均為分析純。藥材均購自合肥市樂家老鋪中藥飲片有限公司。

2 方法與結果

2.1 羌活、獨活提取工藝研究

2.1.1乙醇濃度考察

羌活是經濟價值較高、市場缺口較大的名貴中草藥，含有揮發油、香豆素類及糖類等成分，具有祛風、散寒、除濕、止痛的藥效，臨床多用于治療感冒風寒、頭痛無汗、風寒濕痹、項強筋急、骨節酸疼等；獨活的主要成分包括香豆素類、揮發油類及少量甾醇和糖類，主要用于治療風寒濕痹、腰膝疼痛、少陰伏風頭痛、齒痛等癥[1－2]。根據其理化性質和藥理、臨床應用情況分析，在醇中溶解度優于在水中溶解度，在生產中常用不同濃度乙醇為提取溶劑進行提取，因此采用乙醇回流提取羌活、獨活中有效成分。按處方量配比稱取羌活和獨活藥材，4份，分別加10倍量不同濃度的乙醇回流2次，每次2h，提取液合并，濾過，回收乙醇至無醇味，濃縮，置已干燥的容器中，減壓干燥后，稱重，計算干浸膏得率，并以干膏量、干膏得率和干膏中異歐前胡素總量為指標優選乙醇濃度，結果見表1。可見，隨著乙醇濃度增加，干膏量逐漸減小，異歐前胡素總量在70%和80%時變化不大，在60%以下時相對較少。醇回流的目的是在盡量降低稠膏量的情況下，最大程度的保留有效成分，考慮到大生產的條件以及成本因素，用70%乙醇回流較合適。

表1 不同濃度乙醇提取試驗結果

2.1.2正交試驗設計

選擇加醇量（因素A）、回流時間（因素B）和回流次數（因素C）作為考察因素，以提得的干浸膏中異歐前胡素總量和干浸膏量為考察指標，選擇L9（3）4正交表進行試驗。因素水平表，見表2。

表2 醇提正交試驗因素水平表

2.1.3試驗方法

按處方量配比稱取羌活、獨活藥材9份，按下述正交試驗表，加入70%乙醇，依試驗設計確定的條件進行回流提取，合并提取液，濾過，濾液回收乙醇至無醇味，濃縮，置已干燥的容器中，減壓干燥后稱重，計算干浸膏量并測定異歐前胡素總量。結果及分析見表3至表5。

2.1.4指標測定方法[3－6]

色譜條件：色譜柱為Cosmosil5C18－MS－Ⅱ柱（250mm×4.6mm，5μm），流動相為乙腈－水（58:42），檢測波長為310nm，柱溫為25℃，流量為1.0mL/min，理論板數按異歐前胡素計應不低于4000。

表3 醇提工藝優選正交試驗結果

表4 干膏得率與異歐前胡素含量方差分析

表5 醇提工藝驗證試驗

溶液制備：精密稱取異歐前胡素對照品，加甲醇分別制成每1mL含異歐前胡素0.036mg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。取樣品研細，取約0.5g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加甲醇50mL，密塞，精密稱定質量，超聲處理（功率250W，頻率25kHz）30min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，備用，即得供試品溶液。

測定方法：分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10μL，注入高效液相色譜儀測定，即得。結果表明，樣品中異歐前胡素色譜峰分離度好，色譜圖見圖1。

2.1.5試驗結果分析

以干膏得率為考察指標時，由表3中極差R值可見，各因素作用主次為C＞A＞B；方差分析結果表明C因素有顯著影響，A因素和B因素無顯著影響，因此以A3B3C3為佳條件。以異歐前胡素量為考察指標時，由表3中極差R值可見，各因素作用主次為A＞C＞B；方差分析結果表明，A因素和C因素有顯著影響，B因素無顯著影響，以A2B2C2為佳條件。考慮到異歐前胡素含量較為重要，為了降低稠膏量，保證有效成分以及從大工業生產和節能降耗等全面綜合考察，選擇最佳醇提工藝條件為A2B2C2，即10倍量70%乙醇回流提取2次，每次2h為最佳醇提工藝條件。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.6醇提工藝優選驗證試驗

按處方量配比稱取羌活、獨活藥材3份，分別加入10倍量70%乙醇，按優選的醇提工藝進行試驗，試驗結果見表5。可見，此提取工藝穩定可行。

2.2 防風等藥材揮發油提取工藝研究

2.2.1揮發油提取時間、加水量考察

按處方量配比稱取防風、川芎、藁本和蔓荊子4味藥材3份，置揮發油提取器中，分別加入規定倍量水（見表6），浸泡至透心，按2010年版《中國藥典（一部）》附錄揮發油測定法提取揮發油，從水微沸開始記錄不同提取時間所得揮發油量（mL），至油量不再增加，停止加熱，考察不同提取時間對揮發油量的影響。結果表明，提取時間為4h、加水量為8倍量時，揮發油總量最高，出油率最高。因此，優選的揮發油提取最佳工藝為加8倍量水，提油4h。

表6 防風等揮發油提取時間的選擇

2.2.2揮發油提取驗證試驗

按處方量配比稱取防風、川芎、藁本和蔓荊子4味藥材3份，加8倍量水，用揮發油提取器分別提取揮發油，提取4h，記錄揮發油量。結果3次試驗分別提取揮發油1.5，1.4，1.3mL，平均1.47mL，表明揮發油提取4h較完全，且揮發油得率較穩定。

2.3 水提取工藝研究

2.3.1正交試驗設計

甘草主要為黃酮及皂苷類成分，有緩急止痛、調和諸藥之功效[7－8]。為有效的控制本品質量，選擇甘草的有效成分甘草酸單銨鹽的作為含量測定指標。根據預試驗結果，選定加水量（因素A）、煎煮時間（因素B）和煎煮次數（因素C）作為考察因素，以提得的甘草中甘草酸單銨鹽量和干浸膏量為考察指標，選擇了L9（3）4正交表進行試驗。因素水平表見表7。

表7 水提取工藝優選試驗因素水平表

2.3.2試驗方法

按處方量配比稱取甘草藥材9份，分別和其他按處方量配比稱取的藥材醇提及提油后的藥渣，合并，按正交試驗安排依次進行提取，提取液合并，濾過，濾液濃縮，置已干燥的容器中，減壓干燥后稱重，計算干浸膏量并測定甘草酸單銨鹽的量，結果及分析見表8至表9。

表8 水提取工藝優選正交試驗表

表9 干膏得率及甘草酸單銨鹽方差分析

2.3.3指標含量測定方法[9－11]

色譜條件：色譜柱為Cosmosil5C18－MS－Ⅱ柱（250mm×4.6ID，5μm），流動相為乙腈－2%冰醋酸（40:60），檢測波長為250nm，柱溫為25℃，流速為1.0mL/min，理論板數按甘草酸單銨鹽峰計應不低于2000。

溶液制備：取甘草酸單銨鹽對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成每1mL含75.7μg的溶液，搖勻，即得對照品溶液。取樣品研細，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加流動相25mL，密塞，精密定重量，超聲處理（功率250W，頻率25kHz）30min，放冷，再稱定重量，用流動相補足減失的重量，搖勻，用微孔濾膜（0.45μm）濾過，取續濾液，備用，即得供試品溶液。

測定方法：分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各10μl，注入高效液相色譜儀，測定，即得。結果表明，樣品中甘草酸單銨鹽色譜峰分離度好，色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖

2.3.4試驗結果分析

以干膏得率為考察指標時，由表3中極差R值可見，各因素作用主次為C＞B＞A；方差分析結果表明，C因素有顯著影響，A因素和B因素無顯著影響，以A3B3C3為佳。以甘草酸單銨鹽為考察指標時，由表3中極差R值可見，各因素作用主次為C＞A＞B；方差分析結果表明，C因素有顯著影響，A因素和B因素無顯著影響，以A3B2C2為佳。考慮到甘草酸單銨鹽含量較為重要，為降低稠膏量，保證有效成分以及從大工業生產和節能降耗等全面綜合考察，選擇最佳水提工藝條件為A3B2C2，即10倍量水煎煮2次，每次1h為最佳水提工藝條件。

2.3.5水提取工藝優選驗證試驗

按處方量配比稱取甘草等7味藥材3份，按優選的工藝進行醇提和提油后，藥渣與甘草藥材加10倍量水煎煮2次每次1h，以提得的甘草中甘草酸單銨鹽量和干浸膏量為考察指標，試驗結果見表10。可見，此提取工藝穩定可行，故確定為最佳提取工藝條件。

表10 水提工藝驗證試驗

3 討論

本方為經典古方，療效確切，臨床使用時多為湯劑，使用和攜帶不方便，固對其提取工藝進行優化，制成適合臨床使用的顆粒劑，通過藥理試驗表明，該顆粒具有一定的鎮痛、抗炎等作用。本試驗采用正交設計的考察方法對祛風勝濕顆粒的提取工藝進行優化篩選，確定的最佳提取工藝路線穩定可行，適合工業化大生產。

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