T細胞免疫應答在乙型肝炎病毒感染者診斷中的應用及對免疫調節治療的影響

苑文雯，王 晗，朱劍功，王大剛，楊 寧，李沛然，李 妍，耿 偉，何葉莉，郭桐生

(中國人民解放軍第三〇二醫院臨床檢驗醫學中心，北京 100039)

T細胞免疫應答在乙型肝炎病毒感染者診斷中的應用及對免疫調節治療的影響

苑文雯，王 晗，朱劍功，王大剛，楊 寧，李沛然，李 妍，耿 偉，何葉莉，郭桐生

(中國人民解放軍第三〇二醫院臨床檢驗醫學中心，北京 100039)

目的探討T細胞免疫應答水平的檢測在乙型肝炎病毒感染者診斷以及免疫調節治療中的價值。方法選擇2013年7月至2014年2月就診并符合納入標準的40例患者，于治療前及免疫調節治療1個月、3個月采集外周血，同時選擇同期健康體檢者40例作為對照，分別對血清ALT、AST及T淋巴細胞亞群進行檢測及統計學分析。結果與對照組比較，慢性乙型肝炎患者外周血CD3+T、CD4+T淋巴細胞亞群百分數、CD4+/CD8+T細胞比值顯著降低(P＜0.01)，免疫調節治療過程中，各指標均逐漸升高(P＜0.01)。而慢性乙型肝炎患者血清ALT、AST及外周血CD8+T淋巴細胞亞群百分數水平則顯著高于對照組(P＜0.01)，經免疫調節治療，各指標水平逐漸下降(P＜0.01)。慢性乙型肝炎血清中ALT、AST水平與CD8+T淋巴細胞亞群百分數(P＜0.01)呈正相關；與CD4+/CD8+T比值(P＜0.01)呈明顯負相關。結論乙型肝炎病毒感染患者感染期及免疫調節治療不同階段T細胞免疫應答水平不同，對乙型肝炎病毒感染者的診斷以及免疫調節治療有指導意義。

乙型肝炎病毒；T淋巴細胞；免疫應答；免疫調節治療

乙型肝炎病毒(HBV)是一種嗜肝細胞、非細胞毒性病毒，也是引起慢性肝炎最常見的病毒之一。我國是HBV感染的高流行區，約占全世界HBV感染者的1/3。慢性乙型肝炎具體發病機制尚不十分清楚，但可以通過誘發機體的免疫反應從而間接損傷肝細胞[1]。研究發現，抗原特異性T細胞的免疫應答功能失調與慢性乙型肝炎的發生密切相關[2]。其中，CD4+T細胞功能紊亂導致機體對HBV產生免疫耐受被認為是感染持續的重要因素[3]。

曾有文獻報道過慢性乙型肝炎患者外周血中T細胞亞群的變化，但關于T細胞亞群在慢性乙型肝炎發病及免疫調節治療中動態變化的研究較少。我們對病理診斷確診為慢性乙型肝炎的患者未經免疫調節治療時及治療過程中外周血中各T細胞亞群的變化進行跟蹤檢測，從而系統全面地評價T細胞免疫應答在乙型肝炎病毒感染者診斷及治療中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機選取自2013年7至2014年2月就診的慢性乙型肝炎患者共40例，其中男性25例，女性15例，年齡30～50歲，平均(39.2±8.5)歲。選擇同期健康體檢者40例作為正常對照組，其中男性25例，女性15例，年齡25～55歲，平均(38.6±9.2)歲，均無其他自身免疫性疾病，肝功能正常者。兩組研究對象的性別、年齡比較差異均無統計學意義(P＜0.05)。所有血液樣本的收集均征得患者及體檢者本人的書面知情同意。

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準 ①診斷均符合2000年修訂的《病毒性肝炎防治方案》[4]以及2005年《慢性乙型肝炎防治指南》[5]制定的標準；②不具備排除標準中的任一項。

1.2.2 排除標準 ①重疊其他類型病毒性肝炎、自身免疫性或藥物及酒精性肝炎；②伴有其他自身免疫性疾病；③在納入實驗前未進行抗病毒治療和免疫調節治療。

1.3 樣本采集 慢性乙型肝炎患者于治療前及進行免疫調節治療后第1個月、第3個月靜脈采集外周血樣本，分別記為G0、G1、G3組；采集對照組外周血樣本，記為Gn組。所有外周血樣本經抗凝處理后，置于室溫，避光條件下進行檢測。

1.4 指標選取 根據以往文獻報道及預實驗結果，選取丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)為肝內炎癥判斷指標；測定外周血中T細胞亞群CD3+T、CD4+T、CD8+T百分數及CD4+T/ CD8+T比值。

1.5 檢測方法 使用Olympus AU 5400全自動生化分析儀測定血清ALT、AST，采用FACS Calibur流式細胞技術檢測T細胞亞群的變化。

1.6 統計學方法 采用SPSS17.0軟件進行統計學分析，各組數據先進行正態性檢驗，符合正態分布的數據均以均數±標準差()表示。符合正態分布且方差齊者使用單因素方差分析，否則采用Kruskal-Wallis秩和檢驗進行分析，相關性檢驗用直線相關分析，相關系數為r，取P=0.05為檢驗標準，以P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 血清ALT、AST水平 G0、G1、G3組血清ALT、AST水平均顯著高于對照組，其中G0組最為突出，提示此時病情最為嚴重，在免疫調節治療過程中，G1、G3組的血清ALT、AST水平相比G0組逐漸下降，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表1。

表1 患者與對照組血清中ALT、AST水平比較()

表1 患者與對照組血清中ALT、AST水平比較()

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2.2 外周血T細胞亞群 G0、G1、G3組外周血CD4+T細胞亞群百分數及CD4+/CD8+T比值均低于Gn組，而CD8+T細胞亞群則高于Gn組，其中G0組最為顯著。由G0到G3組，CD4+T細胞亞群百分數及CD4+/CD8+T比值逐漸升高，CD8+T細胞亞群的百分數呈降低趨勢，差異有統計學意義(P＜0.05)，見表2。

2.3 患者血清ALT、AST水平與各項指標的相關性分析 將慢性乙型肝炎患者外周血各指標與肝功能指標ALT、AST進行相關性分析發現，血清ALT、AST與CD8+T淋巴細胞亞群百分數水平呈正相關，而與CD4+/CD8+T比值呈明顯負相關，見表3。

表2 患者與對照組外周血T淋巴細胞亞群比較()

表2 患者與對照組外周血T淋巴細胞亞群比較()

Gn組G0組G1組G3組F值P值70.32±6.42 60.75±3.06 63.85±4.65 65.79±4.80 95.32 0.00 41.2±6.03 25.45±2.28 29.95±4.38 31.10±3.77 57.40 0.00 22.35±4.33 33.05±3.07 29.35±3.18 27.83±2.66 34.74 0.00 1.930.59 0.710.09 1.030.16 1.120.18 52.10 0.00

表3 患者血清ALT、AST水平與各指標間相關性分析

3 討論

機體的免疫功能主要包括體液免疫應答和細胞免疫應答，其中細胞免疫應答主要由T細胞介導[6]。外周血CD4+T細胞可分為Th0、Th1、Th2等功能性亞群，由Th1細胞產生的白細胞介素2(IL-2)、干擾素(IFN-γ)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等細胞因子主要介導機體的細胞免疫，促進乙肝病毒的清除，Th2細胞分泌的IL-4、IL-6、IL-10等細胞因子則主要促進體液免疫反應。CD8+T細胞包括Tc1和Tc2兩個細胞亞群，其中Tc1可分泌IL-2、IFN-γ等細胞因子并且可發揮細胞毒的作用，與Th1共同參與宿主的抗病毒免疫[7]。外周血T細胞的數量、功能及各亞群的構成比反映了機體的細胞免疫狀態，在某些疾病狀態中，任何一種細胞亞群的失調都會影響T細胞介導的機體免疫應答反應[8]。

本研究中我們發現，乙肝患者外周血中的CD4+T細胞百分數降低，CD4+T/CD8+T細胞比值也明顯降低，這可能與感染的慢性化有關，慢性HBV感染的病程消耗了大量T淋巴細胞，使外周血中CD4+T細胞百分數降低，CD4+T細胞是細胞免疫調節的核心調節細胞，CD4+T細胞減少及細胞亞群比例失調都會引起細胞因子表達紊亂，導致不能及時清除HBV[9]。與對照組相比，CD8+T細胞百分數則明顯升高，可能是HBV抗原長期慢性刺激的結果，CD8+T淋巴細胞中的抑制性T細胞對CD4+T細胞具有抑制作用，使得機體不能及時清除乙肝病毒，從而形成惡性循環，導致疾病的發生。

免疫調節治療提高了機體的免疫功能，尤其是對HBV的特異性免疫，從而打破對HBV的免疫耐受，有利于HBV清除。CD4+T細胞百分數及CD4+T/CD8+T細胞比值均較治療前呈增加趨勢，隨著療程的增長，各個治療時期的T細胞亞群水平與治療前相比差異均有統計學意義。此結果表明，對HBV感染患者進行免疫調節治療，不僅能夠抑制乙肝病毒的復制，而且能調動機體的特異性免疫反應，打破機體的免疫耐受，恢復T細胞的功能[10]。

本研究中，我們主要探討了HBV感染者未經治療時及免疫調節治療中外周血中T細胞亞群及相應細胞因子的變化，T細胞亞群以及相應細胞因子在HBV感染發病及免疫調節治療的不同階段變化顯著，提示我們T細胞免疫應答水平不僅是HBV感染者診斷中的重要指標，在免疫調節治療中及時對患者T細胞免疫應答水平進行跟蹤監測，對后續治療計劃的制定及患者預后的判斷也起到重要的指導作用。

[1]張 艷,許春梅,左維澤,等.乙型肝炎患者外周血T細胞亞群、IL-32、IL-6水平的變化及其臨床意義[J].胃腸病學,2010,15(8): 47-51.

[2]廖崇倫,陳 萍.乙型肝炎病毒感染人群T細胞對其抗原蛋白免疫應答的特征分析[J].中華醫院感染學雜志,2013,23(12): 2791-2792,2795.

[3]程勇祥.老年內科腎衰竭患者血液透析的療效及感染的預防[J].臨床合理用藥,2012,5(6C):111-113.

[4]中華醫學會傳染病與寄生蟲病學分會和肝病學分會.病毒性肝炎防治方案[J].中華肝臟病雜志,2000,8(6):324-329.

[5]中華醫學會肝病學分會,感染病學分會.慢性乙型肝炎防治指南[J].實用肝臟病雜志,2006,9(1):8-18.

[6]Kitagishi Y,Kobayashi M,Yamashina Y,et al.Elucidating the regulation of T cell subsets(review)[J].Int J Mol Med,2012,30(6): 1255-1260.

[7]馮 霞,閆惠平,廖慧鈺,等.不同類型乙肝病毒感染者HBV抗原特異性T細胞免疫應答[J].中華實驗和臨床病毒學雜志,2012,26 (4):253-255.

[8]李俊卿.免疫細胞在慢性乙型肝炎免疫耐受機制中的作用[J].臨床肝膽病雜志,2011,27(4):437-440.

[9]Vossenk?mper A,Lutalo PMK,Spencer J.Translational Mini-Review Series on B cell subsets in disease.Transitional B cells in systemic lupus erythematosus and Sj?gren's syndrome:clinical implications and effects of B cell-targeted therapies[J].Clinical&Experimental Immunology,2012,167(1):7-14.

[10]福軍亮,王福生.慢性乙型肝炎患者的個體化免疫調節治療[J].中華檢驗醫學雜志,2011,34(4):300-304.

Application of T cell's immune response in the diagnosis of hepatitis B virus infection and its effect onimmunomodulatory therapy.

YUAN Wen-wen,WANG Han,ZHU Jian-gong,WANG Da-gang,YANG Ning,LIPei-ran,LI Yan,GENG Wei,HE Ye-li,GUO Tong-sheng.

Clinical Laboratory Medical Center,the 302ndHospital of Chinese PLA,Beijing 100039,CHINA

ObjectiveTo evaluate the value of T cell's immune response in the diagnosis of hepatitis B virus infection and its effect on immunomodulatory therapy.MethodsA total of 40 patients who had hepatitis B and have been treated at the hospital from Jul.2013 to Feb.2014 were selected as the objects(the study group).The peripheral blood of the patients was collected before immunomodulatory treatment,1 month and 3 months after treatment.At the same time,40 healthy volunteers were selected as control group(the control group).Alanine aminotransferase(ALT), aspertate Aminotransferase(AST)and T-cell subsets were detected and analyzed statistically.ResultsCompared to the control group,the percentage of CD3+T and CD4+T cell,the ratio of CD4+/CD8+T cell in the study group were significantly decreased(P＜0.01).During the immunomodulatory treatment,all the indexes increased gradually(P＜0.01). However,ALT,AST and the percentage of CD8+T cell were significantly increased in the study group(P＜0.01),andthey were significantly decreased after treatment(P＜0.01).ALT,AST level in the study group were positively correlated with the percentage of CD8+T cell(P＜0.01),and were negative correlated with the ratio of CD4+/CD8+T cell(P＜ 0.01).ConclusionThe patients in hepatitis B virus infection stage and different stages of immunomodulatory therapy vary in T cell's immune response,which can,to a certain extent,guide hepatitis B diagnosis and clinical treatment with immunomodulatory.

Hepatitis B virus;T cell;Immune response;Immunomodulatory therapy

R512.6+2

A

1003—6350（2014）24—3658—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.24.1425

2014-06-15)

郭桐生。E-mail：yuanww1988@163.com