纖維環(huán)針刺法建立兔椎間盤退變模型的實驗研究

鄧燕青，李兵，彭小忠，李百川，卓祥龍，賀慶

(廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院骨科，廣西柳州 545005)

·論著·

纖維環(huán)針刺法建立兔椎間盤退變模型的實驗研究

鄧燕青，李兵，彭小忠，李百川，卓祥龍，賀慶

(廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院骨科，廣西柳州 545005)

目的建立一種穩(wěn)定可靠、可重復性好、成功率高，且與人類退變相似的椎間盤退變模型。方法38只普通級新西蘭大白兔，雌雄不計，隨機選取2只動物用于研究兔腰椎的解剖學特點，另外36只動物用隨機數(shù)字表法均分為模型組和對照組。模型組手術取右側腹膜后入路，暴露至L5/L6、L4/L5椎間盤纖維環(huán)，予16 G穿刺針針刺纖維環(huán)；對照組同法暴露不進行針刺。分別于術前及術后4周對實驗動物行X線和MRI檢查，術后4周處死實驗動物，取椎間盤標本行病理學檢查。結果術后4周，X線和MRI檢查顯示模型組椎間盤高度明顯降低、部分骨贅形成、終板硬化，T2加權像信號較術前明顯降低、椎間盤顏色變黑變暗，髓核縮小或消失，纖維環(huán)變厚；而對照組椎間盤未見明顯變化，T2加權像呈均勻高信號；取椎間盤標本經HE染色，電鏡下見模型組髓核組織明顯縮小，結構紊亂，細胞密度較小，纖維向內塌陷，纖維環(huán)板層出現(xiàn)明顯斷裂，排列不整齊，纖維環(huán)內層見少量毛細血管長入；對照組腰椎間盤病理學檢查無明顯退變表現(xiàn)；免疫組化見模型組椎間盤內TNF-α數(shù)量較對照組明顯增多。結論該方法具有操作簡單、可行、高效等優(yōu)點，是建立椎間盤退變模型的一種可靠方法。

纖維環(huán)針刺法；椎間盤退變；動物模型

椎間盤退變(Intervertebral disc degeneration，IDD)是一系列脊柱退行性疾病的發(fā)生前提和基礎病理過程，臨床上常表現(xiàn)為椎管狹窄、脊柱節(jié)段不穩(wěn)、腰腿痛、頸椎病、椎間盤突出等病癥。傳統(tǒng)的觀點認為IDD主要與過度的身體負荷引起的損傷以及衰老過程中伴隨出現(xiàn)的變化有關，其退變過程是一個很復雜的生理和病理學反應，牽涉到一系列的形態(tài)學、生物學、病理學和生物化學等方面的改變，其具體發(fā)病機制目前尚未完全清楚。本研究主要是通過針刺纖維環(huán)建立椎間盤退變模型，為人類椎間盤退變疾病的研究提供一種可靠的模型。

1 材料與方法

1.1 主要設備與試劑3.0T MRI(德國西門子公司)，DR機(日本津島公司)，病理切片機(德國Leica公司)，光學顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司)，常規(guī)手術器械及動物外科手術臺(廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院生物研究所)，16G無菌穿刺針(廣西醫(yī)科大學第四附屬醫(yī)院消毒供應中心)，戊巴比妥鈉(北京普博斯生物科技有限公司)，TNF-α試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)、青霉素(華北制藥集團)，0.9%生理鹽水(NS)、4%甲醛(自配)。

1.2 實驗動物及分組38只普通級新西蘭大白兔(由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，雌雄不計，排除病兔及孕兔，平均年齡6個月，體質量(2.5±0.5)kg。隨機選取2只動物用于研究兔腰椎的解剖學特點，另外36只動物用隨機數(shù)字表法均分為模型組和對照組。實驗過程中對動物的處置符合2009《Ethicalissues in animal experimentation》動物倫理學標準。

1.3 兔腰椎解剖學特點隨機取2只新西蘭大白兔，其中一只動物予空氣栓塞處死，取下其腰椎及骨盆，剔除肌肉及軟組織后，用堿水煮掉殘余組織，完全暴露腰椎，另一只動物予靜脈麻醉，剝離肌肉軟組織，暴露腰椎；對比分析腰椎的解剖學特點(如圖1)。研究發(fā)現(xiàn)兔的腰椎有7個椎體，在形態(tài)學上L1～L7椎體逐漸增大，椎體兩端扁平，中部凹陷，且沿椎體縱軸前方有骨性棘樣突起。椎弓發(fā)出的突起有三種，包括棘突、橫突和關節(jié)突。棘突1個，較寬短，位于椎弓背側正中，指向背前方；橫突1對，細而長，自椎弓向兩側呈弧形伸展，伸向外側前下方，無肋骨附著。L1～L3橫突較短，L4～L7橫突較長。解剖活兔腰椎發(fā)現(xiàn)L7橫突位于髂骨覆蓋之下，且較L6、L5、L4橫突短而小，暴露較困難，從外體上自尾部往頭側探摸，摸到的位于髂骨下的第一個橫突就L7橫突，通過C臂機透視和在枯骨上可得到證實，繼續(xù)往后探摸可依次摸到L6、L5、L4橫突。相鄰椎體間的關節(jié)由關節(jié)突連接，自椎體向前伸出1對前關節(jié)突，向后伸出l對后關節(jié)突。棘突基底部兩側有l(wèi)對乳突，伸向背前方，較棘突稍低。從形態(tài)學上觀察，兔椎間盤位于相鄰椎體之間，活體椎間盤纖維環(huán)呈銀白色，厚度約為3 mm，中間的椎間盤隆起凸出。從腰椎側面縱向觀察，腰椎橫突與腰椎縱軸成約45°夾角，呈“r”形，椎間盤位于“r”形區(qū)域的夾角根部往頭側約2 mm處，纖維環(huán)呈銀白色。

圖1 兔腰椎解剖

1.4 建立動物模型

1.4.1 術前準備術前禁食24 h，實驗動物稱重，計算所需要的麻醉藥物用量，使用3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)通過耳緣靜脈進行麻醉。麻醉好后予X線和MRI檢查，可排除脊柱先天性畸形和椎間盤病退變，術前備皮(使用硫化鋇對術區(qū)進行脫毛)。

1.4.2 造模方法術前準備完善后，實驗動物取左側臥位，固定于手術臺上，通過探摸橫突定位好L5/L6和L4/L5椎間盤區(qū)域，作好標記(在C臂機透視下證實探摸定位準確)，術區(qū)予碘伏消毒，鋪無菌巾。經右側腹膜后入路，沿右側肋弓下緣與右髂嵴之間的連線取長約3 cm直切口。切開皮膚、皮下筋膜、腹外斜肌、腹內斜肌，鈍性分離至L6橫突，沿著橫突兩側行骨膜下分離肌肉附著點，剝離至L6橫突根部，暴露“r”形區(qū)域，剝離軟組織，完全暴露L5/L6椎間盤纖維環(huán)右側部分，見兔椎間盤位于相鄰椎體之間，中間的椎間盤隆起凸出，纖維環(huán)呈銀白色，觸及有彈性，反復確定椎間盤的節(jié)段。根據(jù)新西蘭大白兔的解剖學特點，穿刺針可取與下位椎體橫突平面呈30°角方向進針(圖2)，用16G無菌穿刺針穿刺到L5/L6椎間盤纖維環(huán)，當穿過纖維環(huán)時可有明顯的突破感，穿刺深度控制約5 mm，連續(xù)穿刺3次，穿刺后可見針尖管內有乳白色果凍狀髓核組織帶出，即穿刺成功；延長切口穿刺L4/L5椎間盤纖維環(huán)；對照組同法暴露至L5/L6、L4/L5椎間盤纖維環(huán)，只暴露不進行穿刺。術畢，生理鹽水沖洗傷口，止血，逐層縫合，輔料包扎傷口；予臀部肌肉注射青霉素(20萬U/次)預防感染，待麻醉清醒后放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。

圖2 穿刺點下

1.4.3 術后處理術后將兔子放回籠中飼養(yǎng)，禁食禁飲6 h后給予普通飲食；術后連續(xù)3 d肌肉注射青霉素(20萬U/次，2次/d)，隔日傷口換藥(總共3次)，預防傷口感染。每日觀察每只兔的精神及活動狀況，注意觀察是否有感染、癱瘓或死亡等異常。

1.5 觀察指標

1.5.1 X線檢查分別于術前、術后4周拍攝腰椎側位X線片，通過CAD軟件測量術前及術后椎間盤高度，計算出椎間盤高度指數(shù)(Disc height index，DHI)，將椎間盤高度指數(shù)百分比(%DHI=術后DHI/術前DHI×100%)作為評估椎間盤的高度變化的指標[1]。

1.5.2 MRI檢查分別在術前、術后4周行腰椎MR(西門子Magnetom Skyra 3.0T MRI，膝關節(jié)線圈，檢查參數(shù)：TR=3 500，TE=135，thickness=2 mm，spacing=0)T2矢狀位掃描，獲得每個椎間盤的T2加權像，所有動物均采用相同的掃描序列。實驗動物取仰臥位，固定好后置于檢查臺上，注意保持實驗動物腰椎成直線，使中間的掃描線經過椎間盤的中份。術后4周退變椎間盤表現(xiàn)均以低信號為主，即T2加權像信號強度降低，且椎間隙變窄。將椎間盤退變Pfirrmann分級系統(tǒng)作為MRI的評估標準(見表1)[2]。

分級ⅠⅡⅢⅣⅤ髓核結構結構完整，均勻一致，白亮結構完整，欠均勻，灰色帶欠完整，灰色，亮度下降不完整，灰黑色信號不完整，黑色信號髓核與纖維環(huán)分界清楚清楚欠清楚消失消失信號強度接近腦脊液高，接近腦脊液中等中等到低信號低信號椎間隙高度正常正常正常或稍窄稍窄狹窄明顯

1.5.3 病理學檢測取標本前先對實驗動物進行心臟灌注，依次為0.9%NS，4%甲醛，灌注完后，完整取下L4/L5和L5/L6椎間盤，予4%多聚甲醛固定，5%硝酸脫鈣，常規(guī)處理后石蠟包埋，正中矢狀切面切片，片厚4 μm。取組織切片，進行常規(guī)HE染色，在光學顯微鏡下觀察。部分椎間盤組織切片按照腫瘤壞死因子α(TNF-α)試劑盒的要求進行免疫組化染色，檢測椎間盤內TNF-α的活性。

1.6 統(tǒng)計學方法各組數(shù)據(jù)應用SPSS16.0軟件采用方差分析進行統(tǒng)計學處理，并進行組間分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

術中因麻醉意外死亡1只，已及時補充，余動物均活動自如，無癱瘓和死亡發(fā)生，術口愈合良好，無感染發(fā)生；實驗組和對照組分別為18只動物，共計責任椎間盤72個。

2.1 影像學表現(xiàn)

2.1.1 X線影像學變化術后4周腰椎側位X線片顯示模型組椎間隙變窄、軟骨終板鈣化以及部分骨贅形成等(如圖3)；對照組椎間盤未見明顯變化。術后4周測得椎間盤高度指數(shù)百分比：模型組L4/L5、L5/L6和對照組L4/L5、L5/L6分別為(69.3±4.2)%、(68.1± 1.8)%、(99.4±0.6)%、(99.1±0.8)%。模型組的椎間盤高度指數(shù)百分比明顯比對照組的低，差異有顯著統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。

圖3 術前及術后4周X線片(A、B)、MRI(C、D)對比

2.1.2 MRI影像學變化術后4周，模型組椎間盤MRI T2加權像信號較術前明顯降低、椎間盤顏色變黑變暗，髓核縮小或消失，纖維環(huán)變厚，椎間盤高度明顯下降(如圖3D)，對照組椎間盤MRI T2加權像始終呈均勻高信號。術后4周椎間盤退變MRI Pfirrmann分級結果見表2，造模4周后結果：模型組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。說明模型構建后4周髓核信號強度降低明顯。

表2 術后4周椎間盤退變MRI Pfirrmann分級（只）

2.2 組織病理學表現(xiàn)

2.2.1 組織大體觀可見對照組和模型組髓核組織居中，均為膠狀物、粘稠，纖維環(huán)較厚，且整齊，包繞髓核；對照組椎間隙清晰，纖維環(huán)及髓核的界限清楚(圖4A)。模型組椎間盤髓核組織泛黃，界限不清，切明顯萎縮，纖維環(huán)排列紊亂，質地脆而硬，穿刺處纖維環(huán)外環(huán)可見部分纖維軟骨形成(圖4B)。

圖4 椎間盤組織大體觀

2.2.2 顯微鏡下觀經HE染色后，光學顯微鏡下見對照組髓核細胞均勻分布，形態(tài)正常，纖維環(huán)呈板層結構；模型組髓核組織明顯縮小，結構紊亂，細胞密度較小，纖維向內塌陷，纖維環(huán)板層出現(xiàn)明顯斷裂，排列不整齊，纖維環(huán)內層見少量毛細血管長入。

2.2.3 免疫組化TNF-α的活性是椎間盤退變的重要指標[3-4]。按照TNF-α試劑盒檢測椎間盤內TNF-α的活性結果顯示，模型組椎間盤內TNF-α數(shù)量較對照組明顯增多。

3 討論

椎間盤退變動物模型研究的根本在于模擬人椎間盤退變后在組織水平、細胞水平甚至分子水平等方面的變化，通過建立椎間盤退變動物模型，可以從形態(tài)學、生物化學、組織免疫學、影像學和分子生物學等多角度、多方向對椎間盤退變過程、病因及發(fā)病機制進行詳盡的研究，以助于闡明人椎間盤退變的發(fā)生機理，以期為椎間盤退變的預防和治療提供依據(jù)。

穩(wěn)定可靠的椎間盤退變動物模型需要滿足以下條件[5]：(1)在倫理學上具有可行性；(2)與人椎間盤退變過程具有相似性和可比性；(3)可重復性好；(4)易于操作且經濟實用。既往有用豬、羊、犬等大型的動物作為造模動物，因麻醉、手術方法、飼養(yǎng)方法等的特殊性，及費用昂貴和對實驗條件要求較高等因素而未能廣泛使用。而大鼠或小鼠等小型動物，雖易于飼養(yǎng)、費用低廉、對實驗條件要求也不高，但由于其椎間盤太小、造模難度較大、成功率較低、影像學表現(xiàn)不明顯等因素亦沒有被推廣。新西蘭大白兔具有價格低廉、飼養(yǎng)方便、抵抗力強、結果可靠、適合大規(guī)模實驗等優(yōu)點，且其椎間盤在解剖和生化結構上與人類椎間盤非常相似，因此本實驗選用新西蘭大白兔作為實驗動物。成年新西蘭大白兔腰椎有7個椎體，其橫突與腰椎縱軸成約45°夾角，呈現(xiàn)“r”形，椎間盤則位于“r”形區(qū)域內的兩個椎體之間，椎間盤纖維環(huán)呈銀白色，較易辨認；其解剖學特點決定了其具有易于暴露、定位準確、直觀、可操作性好、重復性高等優(yōu)點。

有研究表明椎間盤髓核的退變率與纖維環(huán)受損程度密切相關[6]，本實驗采用針刺纖維環(huán)建立椎間盤退變模型也是基于此機制。近年來國外研究人員提出：針刺纖維環(huán)造成纖維環(huán)結構破壞、椎間盤彈性降低，使椎間盤形成了一個新的液體通道，改變了髓核的液體壓力，影響了整個椎間盤的應力，尤其是軸向應力的改變，繼而造成了椎間盤退變[7-8]。椎間盤內部的髓核組織被內外層纖維環(huán)與上下軟骨終板緊密包繞，與周圍循環(huán)毫無法接觸，且椎間盤內缺乏血管，因此其營養(yǎng)主要來自軟骨終板。所以髓核組織與機體免疫系統(tǒng)也是無法接觸的。當刺破纖維環(huán)或軟骨終板這一生理屏障后，髓核組織就會暴露于免疫系統(tǒng)之中，從而引發(fā)自身免疫反應，導致髓核細胞凋亡，炎性細胞侵潤，導致椎間盤退變[9-11]。

造模4周后選用了X線、MRI及組織病理學檢查作為觀察指標[12]。X線片能夠提供椎間盤高度降低、骨贅形成及椎間盤鈣化等病變信息，MRI能夠提供T2加權像信號減低、椎間盤高度下降髓核縮小或消失等退變信息，本研究結果X片及MRI的結果椎間盤高度的丟失、塌陷提示椎間盤退變明顯，表明椎間盤高度是定量分析椎間盤退變程度的重要指標，與人類椎間盤退變過程相似。MRI已成為診斷椎間盤退行性改變最精確的檢查手段之一，MRI能夠描述椎間盤的水分含量以及形態(tài)學變化[13-14]。椎間盤退變，髓核水分丟失，導致椎間盤高度下降，椎間隙變窄。T2加權像對含水量高的組織表現(xiàn)為高信號，而低信號則反映組織脫水、蛋白多糖含量減少、硫酸軟骨素與角質素比率下降等改變[15]，脫水是椎間盤退變的開始，伴隨水分減少和膠原濃度增加，糖蛋白增多，椎間盤纖維化且變硬，其維持高度和分散負荷的能力逐漸下降，從而導致椎間盤高度降低，且在MRI T2加權像上表現(xiàn)為低信號。病理學檢查已成為研究IDD的重要手段，其中HE染色是研究椎間盤組織形態(tài)變化最重要的技術，能夠清楚地顯示各層組織結構[16]；有國外文獻報道[17]：退變椎間盤髓核皺縮變小、纖維化、呈灰黃色；纖維環(huán)與髓核分界不清，正常結構消失；椎間盤前部纖維增生，毛細血管長入，肉芽組織增生；髓核彈性降低，對纖維環(huán)產生異常應力，導致自身膠原的變性、溶解，而引起椎間盤退變。各種細胞因子地變化也是IDD的重要表現(xiàn)，有可靠證據(jù)表明[3-4]：TNF-α也是神經源性疼痛發(fā)生、發(fā)展的關鍵調節(jié)因子，被認為是一種神經調變劑可以誘導炎癥反應和神經張入退變的椎間盤，在退變椎間盤中表達增高。符合本實驗病理學檢查結果。

本造模方法具有操作簡單，對實驗條件要求低，定位準確，成功率高，觀察指標明確，重復性好，且符合人類椎間盤退變規(guī)律等優(yōu)點，為腰椎間盤退變的研究提供了一種簡便、可行、高效的模型研究方法；為進一步研究椎間盤退變性疾病提供了一種可靠的動物模型。

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Construction of rabbit model of intervertebral disc degeneration induced by needle acupuncture in annulus fibrosu.

DENG Yan-qing,LI Bing,PENG Xiao-zhong,LI Bai-chuan,ZHUO Xiang-long,HE Qing.Department of Orthopaedics,the Fourth Affiliated Hospital of Guangxi Medical University,Liuzhou 545005,Guangxi,CHINA

ObjectiveTo establish a reliable,reproducible rabbit model of intervertebral disc degeneration with high success rate.MethodsThirty-eight new Zealand white rabbits of general level,excluding male and female,were enrolled in the study.Two rabbits were randomly selected for the study of the anatomy of the lumbar spine, and the remaining 36 rabbits were randomly divided into model group and control group.The model group after surgery took the right retroperitoneal approach,exposure to L5/L6,L4/L5intervertebral disc,16 G needle acupuncture the annulus.The control group was not exposed to the same method puncture.Preoperative and postoperative four weeks, X-ray and MRI examination were performed.Animals were sacrificed after 4 weeks,and the disc specimens were taken for pathological examination.ResultsAfter 4 weeks,X-ray and MRI examination showed that the disc height in the model group significantly reduced,with partial osteophyte formation and endplate sclerosis,T2-weighted images before the signal was significantly lower than the preoperative,with darkening disc,shrinking or disappeared nucleus, thickening annulus,and decreased disc height.The disc showed no significant change in the control group,T2-weighted images showed homogeneous high signal.The disc specimens were taken for HE staining and electron microscopy, which showed significantly reduced nucleus pulposus,structural disorder,smaller cell density,fiber collapse inward, anular lamellar apparent fracture,irregular arrangement,a small amount of the annulus inner capillary in growth in the model group.Rabbits in the control group had no significant performance of lumbar intervertebral disc degeneration. Immunohistochemistry showed the number of TNF-α of the model group increased significantly compared with the control group.ConclusionThis method is simple,practical and efficient,which is a reliable method to establish the model of disc degeneration.

Needle acupuncture in annulus fibrosu;Intervertebral disc degeneration;Animal model

R-332

A

1003—6350（2014）05—0625—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0246

2013-12-09)

廣西區(qū)自然科學基金（編號：2010gxnssa013257）

李兵。E-mail:aceonelee@gmail.com