BAALC蛋白在急性白血病中的表達及其臨床意義

董小林，張少君，邱桂華，廖雪梅，楊潔

（湖北醫藥學院附屬人民醫院健康體檢中心，湖北十堰 442000）

BAALC蛋白在急性白血病中的表達及其臨床意義

董小林，張少君，邱桂華，廖雪梅，楊潔

（湖北醫藥學院附屬人民醫院健康體檢中心，湖北十堰 442000）

目的探討腦和急性白血病胞質(Brain and acute leukemia cytoplasmic，BAALC)蛋白在急性髓細胞性白血病(Acute myeloid leukemia，AML)的表達及其臨床意義。方法采用Western blot方法半定量檢測BAALC蛋白在58例AML患者(初診24例、完全緩解28例和復發6例)的骨髓單個核細胞(Bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)的表達水平，15例非惡性血液病患者以及AML細胞系KG1α和HL-60分別作為陰性和陽性對照。結果KG1α和HL-60細胞BAALC均為陽性高表達，非惡性血液病對照者BAALC表達均為陰性。BAALC陽性率在AML初診組(83.3%)與復發組(100%)均高于完全緩解(CR)組(7.1%)和陰性對照組(0)(P＜0.001)；AML初診組和復發組的BAALC蛋白相對含量明顯高于CR組和陰性對照組(P＜0.01)，且CR組和陰性對照組之間BAALC表達陽性率和相對含量差異無統計學意義(P＞0.05)。結論BAALC蛋白在AML中表達水平異常增高，提示BAALC可能與AML的發生發展密切相關。

急性髓系白血病；BAALC；完全緩解

腦和急性白血病胞質(Brain and acute leukemia cytoplasmic，BAALC)基因定位于人類染色體8q22.3，最初是在伴有8號染色體三體的AML中鑒定出來的[1]。正常情況下，BAALC基因主要表達在神經組織(如：腦、脊索)和神經外胚層來源組織(如腎上腺、甲狀腺、脾臟)及造血前體細胞如CD34+的早期造血細胞[2]，編碼的蛋白質在高等哺乳動物中的表達高度保守。近年來研究發現，BAALC mRNA在急性髓系白血病高表達，與AML患者的預后切相關，被認為是AML預后較差的指標之一[3-6]。目前，尚未發現BAALC基因編碼的蛋白與目前已知的蛋白有同源性，且BAALC蛋白在AML中的表達研究較少，功能尚不明確。我們采用Western blot方法半定量檢測了AML細胞系KG1α和HL-60以及58例AML患者骨髓單個核細胞(Bone marrow mononuclear cells，BM-MNCs)中的BAALC蛋白表達，并收集了AML患者的臨床資料，追蹤觀察臨床療效，并了解不同病情(初診、完全緩解、復發)AML患者BAALC的表達水平，初步探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料病例來自2010年3月至2012年8月期間我院血液科住院或者門診隨訪AML患者58例，男性33例，女性25例，中位年齡45歲(21～69歲)。AML的診斷、完全緩解、復發標準按張之南主編《血液病診斷及療效標準》[7]，其中初診24例(M02例，M29例，M32例，M511例)，完全緩解(CR)28例(M28例，M38例，M510例)和復發6例(M01例，M23例，M52例)。初診的AML患者接受誘導緩解治療，包括DA(柔紅霉素+阿糖胞苷)、IA(去甲柔紅霉素+阿糖胞苷)、NV(米托蒽醌+衛萌)等化療方案，M3首選全反式維甲酸+DA。獲得CR的患者隨后給予鞏固治療、維持治療或進行造血干細胞移植。非惡性血液病患者15例作為陰性對照，其中巨幼細胞性貧血3例，缺鐵性貧血(IDA)6例，特發性血小板減少性紫癜(ITP)6例。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑人淋巴細胞分離液(Ficoll，北京西美杰科技有限公司)，PIPAⅠ型全蛋白抽提試劑盒(美國DBI Bioscience)，BCA蛋白含量檢測試劑盒(南京凱基生物科技有限公司)，兔抗人BAALC多克隆抗體(美國Abcam)，β-actin抗體和二抗(HRP標記羊抗兔IgG)(美國Santa Cruz)，PVDF蛋白印記膜(美國MilliPore)，ECL化學發光試劑盒(美國Pierce)。

1.2.2 AML細胞系與細胞培養KG1α細胞和HL-60細胞購自中科院上海細胞庫。HL-60細胞和KG1α細胞分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養液，置于37℃、5%CO2飽和濕度培養箱中培養，2～3 d傳代，取處于對數生長期的細胞進行實驗，作為本研究的陽性對照組。

1.2.3 標本采集及單個核細胞分離抽取骨髓液2～5 ml，用肝素抗凝，以磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋后加入人淋巴細胞分離液(Ficoll)上，離心20 min，分離得到單個核細胞，PBS洗滌兩次，細胞沉淀于-80℃凍存備用。

1.2.4 Western blot檢測按照RIPA全蛋白抽提試劑盒的說明提取細胞總蛋白，用BCA蛋白含量檢測試劑盒進行蛋白定量。以每孔40 μg上樣，經10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后電轉至PVDF膜上，5%BSA室溫封閉1 h。BAALC抗體(1:1 200)4℃孵育過夜，以β-actin抗體(1:2 000)為內參照，二抗IgG-HRP(1:4 000)室溫孵育1 h，TBST振蕩洗滌，加入ECL發光液顯色曝光。實驗重復3次。用Image-Pro Plus 6.0軟件分析BAALC與β-actin的灰度比值代表BAALC蛋白的相對含量。

1.3 統計學方法應用SPSS16.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用單因素方差分析，組間均數的比較采用LSD檢驗，率的比較采用Pearson Chi-Square(χ2)檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BAALC蛋白在非惡性血液病對照者和AML細胞系中的表達15例非惡性血液病對照者BAALC蛋白BAALC相對含量為(0.041±0.032)，均為陰性。在KG1α和HL-60白血病細胞株中BAALC均為高表達，BAALC相對半定量值(BAALC/β-actin灰度比)分別為(3.247±0.640)和(1.842±0.385)(n=3，圖1A)。根據陽性對照組、陰性對照組以及實驗組中BAALC蛋白表達水平，該實驗中選定BAALC/β-actin灰度比值≥0.1為高表達，＜0.1為低表達，以此計算BAALC表達的陽性率。

2.2 AML患者BAALC蛋白的表達AML患者BAALC蛋白表達陽性率在初診組(83.3%)和復發組(100%)均高于CR組(7.1%)和陰性對照組(0)(P＜0.001)，CR組和陰性對照組差異無統計學意義(χ2值= 0.09，P=0.764)。采用Pearson Chi-Square(χ2)檢驗比較不同組間BAALC蛋白的表達水平，CR組與陰性組比較，差異無統計學意義(P=0.122)，而初診組和復發組BAALC蛋白明顯低于CR組和陰性對照組(P＜0.05)。有3例AML患者在疾病的不同時期檢測出BAALC的高表達：1例M5患者BAALC/β-actin初診時為1.353，CR時為3.329，且隨訪該患者CR后4個月復發；1例M2a患者初診時為2.629，經化療達完全緩解后，BAALC表達量將至0.173；另1例M2患者CR時為0.087，復發時為1.376(圖1B)。

圖1 BAALC在AML患者和細胞系中的表達情況

3 討論

白血病的發生和發展與多種相關致癌基因過表達或(和)抑癌基因失活有關，其中某些基因的異常表達起關鍵作用。BAALC基因是近年來研究發現的與AML的發生和預后有密切關聯的重要基因之一。BAALC基因最初發現在神經外胚層來源的組織中表達，隨后研究發現來自骨髓的CD34+祖細胞也表達BAALC mRNA，在骨髓祖細胞分化過程中，BAALC的表達水平不斷下調[8-9]，而且BAALC基因主要表達于這兩種組織和細胞。Tanner等[1]研究發現AML、ALL及CML急變期患者可檢測到BAALC基因的高表達，而CML慢性期患者及CLL患者則檢測不到。國內研究者采用實時熒光定量PCR技術檢測到正常成人骨髓中也存在BAALC mRNA的低表達[10]。研究表明，BAALC mRNA在新診斷的正常核型AML高表達，與完全緩解失敗、原發性耐藥和明顯短的總生存和高的復發率有關[11-12]，被認為是AML患者的預后不良指標。也有研究報道在成人前體B細胞ALL患者中，BAALC基因過表達的患者也具有較差的總生存率[13-14]。前述研究主要集中于研究BAALC基因mRNA表達水平與AML的預后關系，而BAALC蛋白在AML發生發展過程中所起的作用尚不清楚。

我們用Western blot方法檢測了BAALC蛋白在KG1α和HL-60白血病細胞系、AML患者以及非惡性血液病患者對照BM-MNCs中的表達。結果表明，BAALC蛋白在KG1α和HL-60細胞均呈高表達，在非惡性血液病對照組表達極低甚至不能測出，而在AML患者初診、完全緩解和復發不同病情時表達程度差異較大，初診和復發患者BAALC蛋白明顯高于完全緩解患者和非惡性血液病患者，且完全緩解和非惡性血液病患者之間表達差異無統計學意義。本研究中發現，1例AML患者BAALC在初診時BAALC表達已有升高，復發時BAALC表達進一步升高；另1例AML患者初診時BAALC表達升高，經治療達CR后BAALC表達下降。

BAALC蛋白的功能研究報道較少。有研究者成功構建BAALC基因的表達載體分別轉染人HL60/ADM、MOLT-4和K562細胞株篩選得到穩定過表達該基因細胞系，發現BAALC基因能促進HL60/ADM細胞株的增殖、抑制凋亡及增加HL60/ADM細胞株拮抗As203誘導凋亡的能力[15]。BAALC基因沉默后能抑制KG1α細胞的增殖和誘導細胞凋亡[16]。表明BAALC基因可能在AML的發生發展過程中起促進作用。

綜上所述，BAALC在AML的發生、進展及演變過程中可能發揮了重要作用，從而有可能成為AML治療的新靶點。

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Expression significance of BAALC in acute myeloid leukemia.

DONG Xiao-lin,ZHANG Shao-jun,QIU Gui-hua, LIAO Xue-mei,YANG Jie.Physical Examination Center,People's Hospital Affiliated to Hubei Medicine College,Shiyan 442000,Hubei,CHINA

ObjectiveTo investigate the expression and its significance of brain and acute leukemia cytoplasmic(BAALC)in acute myeilod leukemia(AML).MethodsBAALC level was assessed by Western blot in the bone marrow mononuclear cells(BM-MNCs)of 58 AML patients,including 24 newly diagnosed patients,28 complete remission patients and 6 relapsing patients,15 nonmalignant hematopathy patients as negative controls and AML cell line KG1α and HL-60 as positive controls.ResultsThe expression of BAALC was positive in KG1α and HL-60 cells but negative in 15 negative controls.The BAALC positive rate in AML newly diagnosed group(83.3%) and relapsing group(100%)was higher than that in complete remission(CR)group(7.1%)and negative control group (P＜0.001).BAALC relative amount in AML newly diagnosed group and relapse group was significantly higher than that in CR group and negative control group(P＜0.01).The positive rate and relative amount of BAALC showed no statistically difference between CR group and negative controls.ConclusionBAALC is overexpressed in AML patients,suggesting that BAALC is associated with the development ofAML.

Acute myeloid leukemia;BAALC;Complete remission

R733.71

A

1003—6350(2014)05—0639—03

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0250

2013-05-28)

楊潔。E-mail：146653354@qq.com