丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對急性淋巴細胞白血病患兒外周血T淋巴細胞免疫功能的影響

劉鋒，鄭玲霞，徐兵，周紅升

(1.中國人民解放軍第171醫院血液科，江西九江 332000；2.南方醫科大學南方醫院血液科，廣東廣州 510515)

丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對急性淋巴細胞白血病患兒外周血T淋巴細胞免疫功能的影響

劉鋒1，鄭玲霞1，徐兵2，周紅升2

(1.中國人民解放軍第171醫院血液科，江西九江 332000；2.南方醫科大學南方醫院血液科，廣東廣州 510515)

目的觀察丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒外周血T淋巴細胞免疫功能的影響。方法對照組為80例健康體檢兒童，試驗組為78例經骨髓穿刺確診為ALL的患兒，試驗組患兒鞘內注射化療藥物治療，期間靜脈注射丙泊酚[(2±1)mg/kg]聯合氯胺酮(0.5 mg/kg)鎮靜麻醉，分別將經骨髓穿刺確診鎮靜麻醉前、鎮靜麻醉6 h后（即鞘內注射前）及鎮靜麻醉24 h后(即鞘內注射并鎮靜麻醉18 h后)的患兒血樣設為TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組。采用流式細胞儀對外周血T淋巴細胞亞群：CD3、CD4、CD8和CD4/CD8的水平和CD4+CD25+CD127-Treg細胞進行檢測。以Ag-NORs、Th1/Th2比值及TGF-β作為免疫學指標，采用KL型腫瘤免疫圖像分析系統對外周血Ag-NORs進行檢測；采用酶聯免疫吸附法檢測Th1/Th2比值及TGF-β的血清濃度水平。結果試驗組患兒外周血CD8、Treg比例、TGF-β水平明顯高于對照組，而CD3、CD4、CD4/CD8比值、Ag-NORs水平及Th1/Th2比值明顯低于對照組，TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組的T細胞亞群及相關免疫學指標差異均無統計學意義。結論ALL患兒較健康兒童機體免疫功能低下，而在診斷和術后使用丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對其外周血T淋巴細胞免疫功能改變無直接影響。

急性淋巴細胞白血病；丙泊酚，氯胺酮；T淋巴細胞；免疫功能；鞘內注射

急性淋巴細胞白血病(ALL)患兒常伴有細胞免疫功能受損，表現為T細胞亞群比例紊亂和功能受損；具有免疫抑制作用的CD4+CD25+Treg細胞及其與瘤細胞共同分泌的轉化生長因子-β(TGF-β)等免疫抑制因子的高表達；輔助T淋巴細胞1型/2型(Th1/ Th2)比例失衡等。ALL目前仍以綜合治療為主，而化療在其治療中占有重要地位，采用鞘內注射是目前治療ALL的一個重要手段。ALL患兒在診斷和化療過程中常要進行鎮靜治療。麻醉和手術可能對ALL患兒的細胞免疫功能有一定影響，研究表明，麻醉藥品可能影響實體瘤與癌癥細胞增殖[1-2]。本研究旨在探討丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對早期ALL患兒診斷和鞘內注射化療后對其外周血T淋巴細胞免疫功能的影響，現報道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究試驗組為2012年1月至2013年6月在解放軍第171醫院和南方醫科大學南方醫院住院的78例患兒，經骨髓穿刺確診為急性淋巴細胞白血病。其中男性44例，女性34例，年齡2～15歲，平均(6.27±3.84)歲。對照組為80例同期來兩醫院進行健康體檢的健康兒童，其中男性42例，女性38例，年齡2～15歲，平均(6.18±3.73)歲。所有病例均符合兒童急性淋巴細胞白血病的診療建議標準[3]；均無腫瘤及自身免疫疾病史；3周內均未接種過疫苗；1周內均未進行過手術治療。

1.2 治療分組本研究分為試驗組和對照組，按照醫學倫理學的基本倫理原則，本研究中暫無骨髓穿刺診斷和鞘內注射化療藥物后未經鎮靜麻醉的對照組，因此試驗設計采用自身前后對照[4]以研究丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對早期ALL患兒診斷和鞘內注射化療后外周血T淋巴細胞免疫功能的影響，并設對照組以研究早期初診ALL患兒外周血T淋巴細胞免疫功能的改變。分別將經骨髓穿刺確診后患兒，經靜脈注射丙泊酚[(2±1)mg/kg]聯合氯胺酮(0.5 mg/kg)鎮靜麻醉前、鎮靜麻醉6 h后(即鞘內注射前)及鎮靜麻醉24 h后(即鞘內注射并鎮靜麻醉18 h后)的患兒血樣設為TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組[4]，如圖1所示。

圖1 試驗組分組方案

1.3 治療方法鞘內注射化療藥物為0.9%生理鹽水(NS)10 ml+甲氨蝶呤(MTX)10 mg+阿糖胞苷(Ara-C)50 mg+地塞米松(DXMS)5 mg，針對MTX耐藥或嚴重頭痛等的不良反應者，也可用阿糖胞苷(Ara-C)50 mg代替。對照組兒童在性別、年齡構成上與試驗組患兒相匹配。

1.4 主要試劑與材料抗CD3、CD4、CD8單抗及CD4-FITC、CD25-PE、CD127-Alexa Fluro 647單克隆抗體及其同型對照抗體等購自美國BD公司；RPMI-1640培養液購置美國GIBCO公司；小牛血清購自廣州蕊特生物科技有限公司；FASC溶血素和流式細胞儀均購自美國BD公司；KL型腫瘤免疫圖像分析系統購自北京健爾康醫療設備有限公司；ELISA試劑盒購自美國eBioScience公司。

1.5 T細胞亞群的檢測分別采集對照組和試驗組兒童空腹下外周血，經肝素抗凝，密度梯度離心法分離得單個核細胞(MNC)，用2 mmol/L的谷氨酰胺和含10%小牛血清的RPMI-1640培養液調成終濃度為1×106/ml后將抗CD3、CD4、CD8單抗加入至100 μl的MNC中，室溫避光孵育30 min，PBS洗2次，用500 μl的2%多聚甲醛固定后避光靜置30 min，流式細胞儀上機檢測。

1.7 免疫學指標的檢測

1.7.1 T淋巴細胞核仁組成區嗜銀蛋白(Ag-NORs)的檢測無菌條件下分別采集對照組和試驗組兒童空腹下外周血，肝素抗凝，取抗凝血500 μl加入到含RPMI-1640培養液中37℃下培養72 h后，取10 ml細胞懸液經離心10min后棄去上清液，加入5 ml低滲液混勻后再加入0.5 ml固定液混勻，離心棄上清，重復操作一遍。沉淀中再加入0.3 ml固定液，混勻后取2滴至預冷載玻片上，過火晾干，然后放于預熱后的鋁板上，去熱后加入4滴染液A和2滴染液B，將蓋玻片輕放于載玻片上，待其為深黃色時取下，凈水洗凈后自然晾干，將染片置顯微鏡載物臺上，經KL型腫瘤免疫圖像分析系統計數30個淋巴細胞銀染核仁區面積與核面積的比值(IS%)。

1.7.2 Th1/Th2及TGF-β的檢測采用酶聯免疫吸附法(ELISA)，利用定量ELISA試劑盒測定對照組和試驗組兒童空腹下外周血血清中Th1/Th2比值(其中INF-γ代表Th1，IL-10代表Th2)和TGF-β的含量(根據試劑盒中樣品標準曲線計算)。

1.8 統計學方法采用SPS13.0統計軟件對數據進行處理，計量資料以均數±標準差(±s)表示，采用大樣本均值間的u檢驗對對照組和試驗組間樣本差異進行顯著性檢驗，以配對資料的u檢驗對TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組間樣本差異進行顯著性檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對照組與試驗組的臨床特征比較對照組和試驗組(鎮靜麻醉前初診患兒)年齡、體重、C反應蛋白、血紅蛋白、白細胞數、血小板數等臨床特征見表1。與對照組比較，急性淋巴細胞白血病患兒有白細胞數增高伴不同程度的血小板減少等血象特征。

表1 對照組與試驗組的臨床特征比較(±s)

表1 對照組與試驗組的臨床特征比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.01。

組別對照組試驗組年齡(歲) 6.18±3.73 6.27±3.84性別比(男/女) 42/38 44/34體重(kg) 24.27±4.17 24.31±3.24血紅蛋白(g/L) 113.45±11.04 63.14±12.36a白細胞數(109/L) 7.21±3.15 67.21±68.35a血小板數(109/L) 138.57±16.28 64.51±31.83aC反應蛋白(mg/L) 7.27±2.53 43.58±37.94a原始淋巴細胞+幼稚淋巴細胞(%) 7.13±1.48 57.46±12.71a

2.2 外周血T細胞亞群的變化比較與對照組比較，試驗組患兒外周血T細胞亞群明顯異常，表現為外周血抑制性T細胞(CD8)明顯高于對照組，而總T細胞(CD3)、輔助性T細胞(CD4)及CD4/CD8比值則明顯低于對照組。所有患兒TG-t0組、TG-t1組和TG-t2組的CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值差異均無統計學意義，見表2。

表2 外周血T細胞亞群變化比較(±s)

表2 外周血T細胞亞群變化比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05。

項目對照組TG-t0組TG-t1組TG-t2組CD3(%) CD4(%) CD8(%) CD4/CD868.52±3.67 40.71±3.82 25.95±6.84 1.48±0.27 47.53±6.25a26.38±4.97a35.62±7.71a0.74±0.24a47.45±6.31a26.41±4.85a35.15±7.53a0.72±0.18a46.79±6.27a26.12±4.74a35.46±7.17a0.71±0.31a

2.4 免疫學指標的變化比較與對照組比較，試驗組患兒血清中Ag-NORs、Th1/Th2比值均明顯低于對照組，而血清TGF-β水平均較對照組明顯升高。所有患兒血清中Ag-NORs、Th1/Th2比值及TGF-β水平差異均無統計學意義，見表3。

表3 免疫學指標變化比較(±s)

表3 免疫學指標變化比較(±s)

注：與對照組比較，aP＜0.05。

組別TGF-β(ng/ml) Ag-NORs(IS%)Th1/Th2對照組TG-t0組TG-t1組TG-t2組1.06±0.38 1.28±0.47a1.31±0.52a1.30±0.49a8.66±0.78 5.91±0.74a5.87±0.68a5.89±0.72a1.24±0.32 1.08±0.38a1.06±0.34a1.05±0.37a

3 討論

急性淋巴細胞白血病為一種骨髓惡性細胞惡性克隆性疾病，其前體淋巴細胞增值代替了骨髓的正常造血功能。鞘內注射化療藥物是ALL治療的重要手段，但長時間手術應激往往會降低患者的免疫功能，導致術后感染和增加病情風險[6]。麻醉能減少術后引起的應激反應，但不同麻醉方法與麻醉藥品本身可能會對患者的免疫功能造成影響，一定程度上影響ALL患者的治療與預后，因此，麻醉對ALL患兒的免疫功能的影響不容忽視。異丙酚為臨床上最常使用的靜脈全麻藥，關于異丙酚對機體免疫功能的影響已進行了大量的研究，認為異丙酚比吸入麻醉藥更能保護機體免疫功能[7]。有學者關于異丙酚和異氟醚對手術引起的免疫應答的影響研究表明，異丙酚能更好地減輕手術引起的應激反應[8-9]。氯胺酮為臨床常用靜脈全麻藥，臨床亞劑量的氯胺酮具有很強的鎮靜作用。Beilin等[10]的研究表明，麻醉誘導前靜注小劑量氯胺酮，IL-2保持術前水平而IL-6與TNF-α分泌減少，有利于患者圍術期免疫調節平衡。然而未見關于丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對ALL患兒診斷和鞘內注射化療后是否有細胞免疫功能影響的報道。本文旨在研究急性淋巴細胞白血病患兒外周血T淋巴細胞免疫功能，以了解其免疫狀態，并觀察診斷和術后使用丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對其外周血T細胞亞群及細胞免疫功能的影響。

ALL的發生、發展與多種因素有關，當機體免疫功能紊亂或低下時，ALL的發病率增高。T淋巴細胞在腫瘤的發生、發展及其治療中發揮重要作用，其中CD4+細胞主要為輔助性T細胞(Th)，可分為Th1、Th2、Th17三類效應細胞；而細胞主要由細胞毒性和抑制性T細胞組成。本研究結果表明，試驗組患兒外周血T細胞亞群較對照組明顯異常，表現為CD8明顯高于對照組而CD3、CD4及CD4/CD8比值則明顯低于對照組，與已有文獻報道一致[11]，而所有患兒在診斷和術后使用丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對其外周血CD3、CD4、CD8及CD4/CD8比值影響均差異無統計學意義。

為進一步比較丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對ALL患兒細胞免疫功能的影響，選擇以下指標進行檢測[15]：(1)Ag-NORs(2)Th1/Th2比值(3)TGF-β。Ag-NORs為RNA聚合酶亞單位，其表達水平與機體腫瘤生長狀況密切相關，可作為腫瘤診斷和病情檢測的重要指標，其含量減少表明機體的免疫功能降低。Th1/Th2兩類細胞因子平衡失調是導致許多疾病免疫功能低下的基礎，Th1細胞選擇性產生促炎癥因子，如IL-1和INF-γ，而Th2細胞選擇性產生抗炎癥因子，如IL-4和IL-10，Th1/Th2比值可反映機體抗腫瘤狀態，Th1向Th2偏移則導致免疫抑制狀態。而TGF-β能反映腫瘤對機體免疫應答的抑制程度。研究表明，試驗組患兒的Ag-NORs和Th1/Th2比值較對照組均顯著降低，而TGF-β水平顯著升高，與文獻報道一致[15]。同時所有患兒在診斷和術后使用丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對其外周血各項免疫學指標影響差異均無統計學意義。

綜上所述，細胞免疫紊亂是導致ALL發生與病情發展的重要原因和嚴重后果，該研究表明ALL患兒機體免疫功能低下，而在診斷和術后使用丙泊酚聯合氯胺酮麻醉對其外周血T淋巴細胞免疫功能無直接影響。因而提示，丙泊酚聯合氯胺酮麻醉是ALL患兒化療手術中一種較理想的麻醉方法。

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Effects of propofol combined with ketamin on the changes in immune function of T lymphocytes in peripheral blood from children with acute lymphocytic leukemia.

LIU Feng1,ZHENG Ling-xia1,XU Bing2,ZHOU Hong-sheng2.1.Department of Hematology,the 171stHospital of Chinese PLA,Jiujiang 332000,Jiangxi,CHINA;2. Department of Hematology,Nanfang Hospital of Southern Medical University,Guangzhou 510515,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo explore the effects of propofol combined with ketamin on the changes in immune function of T lymphocytes in peripheral blood from children with acute lymphocytic leukemia(ALL).MethodsA total of 80 healthy children were selected as the control group,while 78 children with ALL diagnosed by bone marrow aspiration were enrolled as the study group.Patients in the study group undergoing lumber puncture with chemotherapeutics received sedation with IV propofol[(2±1)mg/kg]and ketamine(0.5 mg/kg).Blood samples of patients before sedation for bone marrow aspiration was represented as TG-t0,sedation 6 hours after TG-t0(before lumber puncture with chemotherapeutics)was represented as TG-t1,and 24 hours after TG-t0(during lumber puncture with chemotherapeutics sedation 18 hours)was represented as TG-t2.Levels of T lymphocyte subsets and CD4+CD25+CD127-Treg cells were detected by flow cytometry.The ratio of Ag-NORs,Th1/Th2 and TGF-β were used as cellular immune indicators.A KL image system was used to analyze the ratio of Ag-NORs of T lymphocytes,and ELISA assay was employed to investigate the Th1/Th2 and levels of TGF-β in serum.ResultsThe proportion of CD8 cells and Treg cells and levels of TGF-β in serum from patients in the study group were higher than those of the control group.There were no significant differences in the levels of T lymphocyte subsets and cellular immune indicators among group TG-t0, group TG-t1 and group TG-t2.ConclusionChildren withALL have lower immune function,and sedation with propofol-ketamine combination may not affect the immune function of T lymphocytes in peripheral blood directly.

Acute lymphocytic leukemia;Propofol;Ketamin;T lymphocyte;Immune function;Lumber puncture

R733.71

A

1003—6350（2014）05—0693—04

10.3969/j.issn.1003-6350.2014.05.0269

2013-08-09)

劉鋒。E-mail：liufeng171126@126.com