細菌性肺炎快速診斷基因芯片的初步構建

董進浪，李 華，汪 健，王小中，胡曉彥，曾林祥

（1.煙臺市萊陽中心醫院檢驗科，山東萊陽265000；2.南昌大學第二附屬醫院，江西南昌330006）

細菌性肺炎快速診斷基因芯片的初步構建

董進浪1，李 華2＊，汪 健2，王小中2，胡曉彥2，曾林祥2

（1.煙臺市萊陽中心醫院檢驗科，山東萊陽265000；2.南昌大學第二附屬醫院，江西南昌330006）

目的 根據細菌16SrRNA基因特點設計常見病原菌的特異性探針，采用酶顯色技術構建基因芯片，探討其臨床應用的可能性。方法 選取肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌及銅綠假單胞菌等8種細菌性肺炎常見的病原菌的標準菌株作為研究對象，并選擇12份患者的痰液標本進行檢測。在16SrRNA基因保守區設計PCR反應的通用引物及革蘭陽性菌、革蘭陰性菌的通用探針，利用可變區的差異設計合成特異性探針，構建基因芯片。利用細菌16S rRNA基因設計的PCR通用引物進行擴增，所有8種細菌均獲得350bp的擴增產物。以地高辛標記特異性探針，構建完成可用于8種常見病原菌檢測的基因芯片，結果 8種標準菌株基因芯片檢測均取得了預期效果，對12份痰標本中常規培養陽性7份，其對應芯片檢測結果均成陽性，5份常規培養陰性的標本中，芯片結果提示陽性的有3份，其中1份為嗜肺軍團菌，2份為使用抗生素后的患者標本。結論 設計合成的PCR通用引物對擴增細菌的16SrRNA基因具有較高的特異性及靈敏度。構建的基因芯片可用于常見細菌性肺炎病原菌的檢測鑒定，且對抗生素使用后的臨床標本及苛養菌有一定的診斷價值。本研究所獲得基因芯片對于細菌性肺炎的檢測具有簡單、快速、特異性及敏感性高的特點。

16SrRNA；基因芯片；細菌性肺炎

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1048）

細菌性肺炎是威脅人類健康的一種重要疾病，發病率和死亡率均較高。目前細菌性肺炎的病原學診斷主要依靠細菌培養或免疫學檢測等方法。細菌培養用于病原學診斷存在許多不足：培養至少需要2－3天，并且患者在使用抗生素后易出現假陰性，若培養基中混有生長迅速的污染菌，往往會影響病原菌的分離；免疫學檢測方法是通過檢測血清中的特異性抗原、抗體或觀察雙份血清標本抗體滴度的變化，判斷病原體感染，由于部分抗體形成較晚，免疫學檢測方法常用于回顧性診斷，不建議作為確診依據［12］。尋找更為快速、簡便、實用的病原學檢測方法是臨床發展的需要。本研究根據細菌16SrRNA基因的特點，設計建立一種基因芯片，擬解決細菌性肺炎快速診斷病原菌的問題。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株 選擇8種細菌性肺炎常見病原菌的標準菌株：肺炎鏈球菌（ATCC 31001），金黃色葡萄球菌（ATCC 25923），大腸埃希菌（ATCC 25922），流感嗜血桿菌（ATCC 33391），肺炎克雷伯菌（ATCC 46114），鮑曼不動桿菌（ATCC 25285），銅綠假單胞菌（ATCC 27853）和嗜肺軍團菌（ATCC 33152）作為研究對象，同時選擇12份呼吸道感染并且經痰液涂片革蘭染色符合細菌培養要求的痰液標本進行細菌培養檢測。

1.2 芯片構建與檢測 試劑盒DIG DNA標記試劑盒Ⅰ（DDLK－010）、地高辛雜交檢測試劑盒Ⅰ（DIGD－110）、Hyb高效雜交液均購自深圳依諾金生物科技有限公司。

1.3 細菌性肺炎常見病原菌的檢測 所有實驗操作均嚴格按照《全國臨床檢驗操作規程》（第三版）進行［3］。細菌鑒定根據菌落特點和革蘭染色及觸酶、氧化酶等試驗上機鑒定（VITEK－32，法國生物梅里埃），藥敏試驗應用瓊脂稀釋法對病原菌進行MIC（mg／L）測定，判斷結果參照臨床和實驗室標準協會（CLSI）2010年版標準執行。

1.4 嗜肺軍團菌抗體IgM檢測 間接免疫熒光法檢測嗜肺軍團菌抗體IgM，試劑盒來自德國歐蒙醫學診斷技術有限公司。檢測特異性IgM類抗體前，需去除樣本中的IgG類抗體。

1.5 細菌DNA的提取 采用煮沸法提取細菌DNA：50μl生理鹽水，挑取1－2個血平板上過夜培養的菌落，加入50μl DNA裂解液，混勻，100℃煮沸10min，12 000rpm離心5min，吸取上清液置－20℃儲存。

1.6 16S rRNA基因PCR擴增

1.6.1 引物探針的設計合成 從GenBank及Ribosomal Database Project－Release 10數據庫中檢索8種病原菌的16SrRNA全序列（patial，1 300bp以上），每個菌種選取10個不同型別的sequence文件。將以上80個sequence文件轉換成DNAStar格式，導入DNAStar程序的SeqManⅡ模塊進行序列比較分析，確定細菌的高度保守區和各病原菌的相對特異區。將設計好的候選引物和探針輸入Ribosomal Database Project－Release 10數據庫中在線分析，驗證其特異性和敏感性。

1.6.2 PCR擴增 將提取好的細菌DNA樣品在20μl反應體系進行擴增。PCR條件：94℃初變性30s，52℃退火45s，72℃延伸60s，進行30－35個循環后72℃延伸10min。取出PCR擴增產物備用。

1.7 基因芯片的制備

1.7.1 探針的合成和修飾 設計好的探針由上海生工生物技術有限公司合成，探針在5’端氨基修飾加T至400bp大小，以便固定于NC膜上。

1.7.2 芯片點樣 20×SSC中將NC膜預濕，室溫干燥后備用，依次將探針及對照點樣于NC膜上（0.5CM間隔）待干。置60℃烤箱中干烤固定2h備用。

1.8 芯片雜交及檢測

1.8.1 預雜交 將制備好的NC膜置于無菌離心管中，加入5ml高效雜交液，將雜交儀設定為65℃，8－15rpm預雜交1－2h。

1.8.2 雜交 ①地高辛標記PCR產物的變性處理：將標記好的PCR產物放100℃煮10min，立即放冰浴冷卻10min。②將雜交管取出，倒出預雜交液，另取適量的高效雜交液5－10ml，加入變性過的地高辛標記PCR產物1－3μl／膜，或5－20ng／ml高效雜交液，混勻。加入到雜交管中，雜交儀設定為65℃，8－15rpm雜交4h。

1.8.3 酶聯顯色 ①將雜交和嚴謹洗滌后的NC膜在洗滌緩沖液中浸潤1－5min。②在30ml阻斷液中孵育30min。③在10ml抗體液中孵育30分鐘。④在30ml洗滌液洗滌2×15min。⑤在15ml檢測緩沖液中平衡2－5min。⑥加入10ml顯色底物液避光反應15min，勿搖動。⑦用50ml雙蒸水或TE－緩沖液漂洗NC膜5min終止反應。肉眼觀察結果。

2 結果

2.1 引物與探針設計

經SeqManⅡ聚類分析，80個16SrRNA基因全序列總長1 656bp，共有區域為第80－1540bp。選擇839－890區，1177－1217區設計通用引物；中間891－1176的多色區域為可變區，用于設計革蘭陽性菌、革蘭陰性菌及各病原菌的特異性探針，如圖1。

在Ribosomal Database Project－Release 10數據庫中分別驗證各病原菌探針的特異性和敏感性，特別關注每種菌中我們預選的8株菌的序列是否包含在其中，以及是否存在非特異菌種及其引起肺炎的可能性。

2.2 PCR反應條件優化及產物驗證

2.2.1 梯度PCR（大腸埃希菌標準菌株ATCC25922）：上游引物Sense：5’AGCAAACAG GATTAGATACC 3’，Tm：53.7℃；下游引物Anti－Sense：5’CGGGACTTAACCCAACAT3’，Tm：55.02℃。退火溫度梯度設置為：52℃52.3℃53.2℃54.4℃55.8℃57.3℃，退火溫度為52℃時，條帶最純最亮，如圖2。

2.2.2 7種病原菌的標準菌株PCR產物電泳結果如圖3（52℃退火）。金黃色葡萄球菌標準菌株ATCC25923在DNA模板量加倍后PCR，以大腸埃希菌標準菌株（ATCC25922）DNA模板原量做對照，結果如圖4。

圖1 SeqManⅡ聚類分析839－1217區保守序列與可變序列分布情況

圖2 大腸埃希菌ATCC25922梯度PCR產物電泳

圖3 7種病原菌標準菌株PCR產物電泳

圖4 金黃色葡萄球菌DNA模板量加倍后PCR產物電泳

2.2.3 大腸埃希菌標準菌株（ATCC25922）PCR產物測序，委托六合華大基因科技股份有限公司（訂單編號W100906－0791－004）。ATCC25922序列與PUBMED序列的比對結果（如圖4）顯示，PCR擴增成功，上下游引物設計達到預期要求。

2.2.4 地高辛標記PCR產物 地高辛標記PCR產物電泳，被標記的片段較小，肉眼觀察標記前后的泳動位置差別不大。按照loading buffer（6×）1μl＋5μl DIG PCR產物電泳，條帶比較亮。地高辛標記PCR產物的標記效率檢測（NC膜上顯色）地高辛標記PCR產物在NC膜上可進行特異的雜交，效率與酶標陽性對照效率相當，如圖5，6。

2.3 基因芯片的雜交結果

地高辛標記PCR產物雜交檢測芯片酶聯顯色結果，見圖7，8。構建的基因芯片用于8種常見細菌性肺炎致病菌的檢測鑒定，均獲得了特異性的斑點。

圖5 地高辛標記PCR產物電泳驗證

圖6 地高辛標記PCR產物的標記效率

圖7 芯片探針點樣示意圖

2.4 12份痰標本細菌培養與芯片檢測結果對比

在12份痰標本中常規細菌培養陽性7份，其對應芯片檢測結果均成陽性，5份常規培養陰性的標本中，芯片結果提示陽性的有3份，其中1份為嗜肺軍團菌，2份為使用抗生素后的患者標本，見表1。

3 討論

細菌性肺炎是嚴重威脅人類健康的疾病，發病率和死亡率均較高，早期病原學診斷對于合理選擇抗生素，減少細菌耐藥性的產生及其引起的經濟損失，縮短患者住院時間，降低患者死亡率，具有重要意義。傳統的細菌培養是病原學診斷的金標準，但費時長且陽性率低。

通過回顧性調查，結合文獻報道，本文篩選出了細菌性肺炎常見的8種病原菌：肺炎鏈球菌，流感嗜血桿菌，肺炎克雷伯菌，金黃色葡萄球菌，嗜肺軍團菌（間接免疫熒光法檢測IgM抗體），大腸埃希菌，銅綠假單胞菌及鮑曼不動桿菌，占細菌性肺炎病原菌菌種分布的90%以上［4－5］。近年來，肺炎支原體、肺炎衣原體及真菌感染在病原體肺炎中的比例呈上升趨勢，因其引物探針選擇區域及PCR條件與細菌不同，未納入本研究范圍。

通過DNAStar軟件中SeqmanⅡ模塊的聚類分析，本課題篩選出在細菌16SrRNA基因高度保守區域設計通用引物，在相對保守區域內設計革蘭陽性菌探針和革蘭陰性菌探針，在高度可變區設計8種常見病原菌的特異性探針，并經Ribosomal Database Project－Release 10數據庫信息比較驗證。該選定區域序列總長為327bp，以80種檢索細菌的通用序列為標準，選定的序列區間為（857，1194），與Greisen，K等［6］選取的（976，1359）有差異。本區間經Ribosomal Database Project－Release 10數據庫查詢合理，在今后的研究中，還需進一步檢測更多標準菌株及臨床分離株，目前尚不足以評價該區間是否優于文獻報道。

圖8 地高辛標記PCR產物雜交檢測芯片酶聯顯色結果

表1 12份痰標本細菌培養與芯片檢測結果對比情況

本文針對自行設計的引物探針，以標準菌株及少量臨床標本對細菌DNA模板抽提方法選擇，PCR條件的探索，芯片雜交條件的優化等方面，不斷嘗試，取得了初步結果。

細菌DNA的提取方法對PCR實驗的成功與否，至關重要。常用的化學法，煮沸法等提取方法，對革蘭陰性菌有良好的效果。因金黃色葡萄球菌細胞壁的特殊脂質成分，即使加入溶葡萄球菌素等試劑成分，DNA提取效果仍不理想，據D.Nicholas Adams［7］的方法，直接以一定濃度的金黃色葡萄球菌菌液做PCR的DNA模板，卻能取得較好效果，其原因有待進一步研究。

在芯片雜交條件的摸索上，各特異性探針本身只有20－30bp，分子太小，很難直接點樣固定于硝酸纖維素膜上（孔徑200μm），可采用探針加尾，以增加分子大小。

雜交實驗的成敗與酶聯顯色系統的性能也有很大關系，為保證顯色系統有效性，可在芯片適當位置點樣酶標抗體做陽性對照。

在芯片雜交檢測臨床樣本時，2例使用抗生素后細菌培養陰性的標本與嗜肺軍團菌抗體IgM陽性標本均呈有色反應，這與使用抗生素后常規細菌培養陽性率太低及嗜肺軍團菌為苛養菌難以常規培養有關。科學觀察芯片雜交檢測的特異性與敏感性，需要更多的臨床實驗與數據。

［1］Li X，Morgenroth E，Raskin L.Quantitative rRNA－targeted solution－based hybridization assay using peptide nucleic acid molecular beacons［J］.Appl Environ Microbial，2008，74：7297.

［2］Liao JC，Mastali M，Gau V，et al.Use of electrochemical DNA biosensors for rapid molecular identification of uropathogens in clinical urine specimens［J］.J Clin Microbial，2006，44（2）：561.

［3］中華人民共和國衛生部醫政司編.全國臨床檢驗操作規程［M］.第3版.南京：東南大學出版社，2006：744－745.

［4］劉又寧，陳民鈞，趙鐵梅，等.中國城市成人社區獲得性肺炎665例病原學多中心調查［J］.中華結核和呼吸雜志，2006，29（01）：3.

［5］孫宏莉，王 輝，陳民鈞，等.2007年中國10所教學醫院革蘭陽性球菌耐藥性研究［J］.中國感染與化療雜志，2009，9（2）：106.

［6］Greisen K，Loefflholz M，Porohit A，et al.PCR primers and probes for the 16SrRNA gene of most species of pathogenic bacteria，including bacteria found in cerebrospinal fluid［J］.J Clin Mi－crobiol，1994，32：335.

［7］Aolams DN.Shortcut method for extraction of Staphylococcus aureus DNA from blood cultures and conventional cultures for use in realtime PCR assays［J］.J Clin Microbiol，2005，43（6）：2932.

Construction of gene chip and its application in bacterium pneumonia

DONG Jin－lang1，LI Hua2，WANG Jian2，et al.
（1.Laiyang Central Hospital of Yantai，Laiyang265000，China；2.The Second Affiliated Hospital of Nanchang U－niversity，Nanchang330006，China）

Objective According to the characteristics of bacterial 16SrRNA gene，design specific probe to common pathogenic bacteria.Use of chromogenic enzyme gene chip technology and explore its clinical application.Methods Select Streptococcus pneumoniae，Haemophilus influenzae，and Pseudomonas aeruginosa eight kinds of bacterial pneumonia common standard strains of pathogens as the research object，and select the 12patients with sputum specimens for testing.Universal primers designed to conserved regions of the 16SrRNA gene PCR reactions and Gram－positive bacteria，Gram－negative bacteria universal probe，using the variable region of design differences SYNTHESIS specific probe，constructed gene chip.The use of bacterial 16SrRNA gene PCR universal primers designed to amplify all eight species of bacteria were obtained amplification product of 350bp.Digoxin labeled with specific probes can be used to complete construction of eight common pathogen detection microarray.Results 8standard strains of gene chips have achieved the desired effect.We detected 12sample of sputum，and 7cases culture－positive which corresponds to the chip test results were positive.In 5samples with negative culture results，there remained 3positive in gene chips，1identified as Legionella pneumophila and 2cases with antibiotics treatments earlier.Conclusion Currency primer of 16SrRNA has attributes of high specificity and sensitivity.Gene chip we constructed can be applicated to detect common clinic pathogen of bacterical pneumonia and clinic specimens，even those antibiotic use after clinical specimens and fastidious bacteria have certain diagnostic value.In this study，the gene chip for the detection of bacterial pneumonia is simple，fast，high specificity and sensitivity.

16SrRNA；Gene Chip；Bacterial Pneumonia

Q78

A

2013－10－20）

1007－4287（2014）07－1048－05

江西省衛生廳基金資助項目（20061079）

＊通訊作者