不同方法獲取的腫瘤細胞提取物對肺癌細胞殺傷作用的實驗研究

趙 鑫，劉玉俠，常 穎，盧衛平，王啟文，王 寶，段北野，王 斌＊

（1.吉林省腫瘤醫院，吉林長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長春130012）

不同方法獲取的腫瘤細胞提取物對肺癌細胞殺傷作用的實驗研究

趙 鑫1，劉玉俠2，常 穎1，盧衛平1，王啟文1，王 寶1，段北野2，王 斌1＊

（1.吉林省腫瘤醫院，吉林長春130012；2.吉林省腫瘤防治研究所，吉林長春130012）

本實驗從抗原提取方法入手，采用梯度鹽水法對加熱和未加熱的肺腺癌細胞SPC－A－1進行腫瘤細胞提取物提取，以此作為抗原，比較不同方法提取的腫瘤抗原在體外與人外周血淋巴細胞共同培養后對肺腺癌細胞SPC－A－1的殺傷活性，探討腫瘤抗原的有效獲取方法以及不同濃度抗原對腫瘤細胞的體外殺傷效果，為腫瘤抗原的獲取和臨床應用提供實驗數據。

1 材料和方法

1.1 細胞株 SPC－A－1，購自上海生物細胞研究所。

1.2 試劑 IMDM培養基，胎牛血清，購自Hyclone公司；IL－2，購自北京四環生物制藥有限公司；淋巴細胞分離液，購自中國醫學科學院生物工程醫學研究所；MTT，購自Sigma公司。

1.3 梯度高滲鹽水法提取腫瘤細胞提取物

3次上清總和用紫外分光光度計測定OD280，OD260吸光度，計算蛋白含量蛋白含量（mg／ml）＝1.45OD280－0.74OD260＝0.432mg／ml。未水浴加熱的SPC－A－1細胞同上方法提取腫瘤細胞提取物，測蛋白濃度。

1.4 MTT法測定CTL活性

1.4.1 效應細胞的制備 按照試劑說明制備人外周血淋巴細胞懸液，調濃度為5×106／ml，加入24孔細胞培養板內，0.5ml／孔，細胞數為2.5×106個／孔，再加入提取的不同濃度的腫瘤細胞提取物，濃度分別為5μg／ml，10μg／ml，20μg／ml，40μg／ml，37℃，5%CO2飽和濕度條件下培養3天，即效應細胞（E）。

1.4.2 靶細胞的制備 取處于指數生長期的SPC－A－1細胞，調濃度為1×106／ml，即為靶細胞（T）。加入24孔培養板相應孔內，50μl／孔，效靶比為50∶1。

1.4.3 MTT法檢測CTL活性 參照文獻［1］介紹的方法略加修改。效應細胞與靶細胞混合培養24h后加入MTT（5 mg／ml）100μl／孔，繼續培養4h，收獲各孔細胞，離心，棄掉上清，加DMSO，1ml／管，室溫下用滴管反復吹打各管至結晶物全部溶解，加入96孔培養板內，全自動酶標儀測定OD492值。

1.4.4 CTL活性計算公式 CTL活性（%）＝［1－（ODE＋T－ODE）／ODT］×100%。

1.5 統計學處理

應用SPSS V16.0軟件，采用t檢驗對數據進行處理。

2 結果

不同方法處理的SPC－A－1細胞提取物對外周血淋巴細胞CTL活性的影響，見下表1。從表中可以看出，加熱提取的抗原在濃度為20μg／ml，40μg／ml，時，對CTL活性的提高有明顯作用（P＜0.01，與加IL－2組相比），而未加熱的抗原在濃度為40μg／ml時與加IL－2組比較有明顯差異。在同濃度抗原的比較中，加熱組較未加熱組的CTL活性高（P＜0.05，濃度為20μg／ml；P＜0.01，濃度為40μg／ml）。

表1 不同方法處理的SPC－A－1細胞提取物對外周血淋巴細胞CTL活性的影響（n＝6）

3 討論

T細胞介導的免疫應答在腫瘤免疫排斥過程中占有重要地位。如CD8＋CTL可識別，殺傷帶有腫瘤抗原的腫瘤細胞，CD4＋T細胞通過釋放細胞因子放大CTL反應，但它們的活化都是腫瘤抗原刺激的結果。因而，腫瘤抗原提取方法的選擇顯得十分必要。在本實驗中，我們選用了不同條件處理的腫瘤細胞經過梯度高滲鹽水法提取腫瘤抗原，結果證明43℃熱處理后提取的抗原比未加熱處理的抗原在體外對人外周血CTL細胞活性的激活效果更好。

熱休克蛋白（heat shock protein，HSP）是體內一類重要的應激蛋白［2］，在受到高溫或其它因素強烈刺激時即可產生。Li和Srivastava［3］研究證明，天然HSP可與胞漿內數百種多肽結合，HSP與此內源性抗原多肽形成復合物，即熱休克蛋白－抗原肽復合物（HSP－antigen peptide complex，HSPPC）。此HSP－PC能夠對該腫瘤細胞產生特異性殺傷作用，這種殺傷作用不是來自于HSP本身，而是來自于與HSP相結合的短肽。HSPs能與腫瘤特異性抗原組成HSP－多肽復合物，增強腫瘤抗原的穩定性和免疫原性，激活單核－巨噬細胞系統、活化自然殺傷細胞（NK）等，引發固有免疫反應，非特異性的殺傷腫瘤細胞；同時促使腫瘤抗原提呈，引發特異性免疫反應，提高機體對腫瘤的體液免疫和細胞免疫的能力［4，5］。大量實驗證實［6，7］，HSP能提高特異性CD8＋T淋巴細胞對腫瘤細胞表面抗原的識別，通過MHC I類分子的遞呈作用殺傷腫瘤。

本實驗通過對肺癌細胞SPC－A－1進行加熱處理提取腫瘤細胞提取物作為抗原，其中包含有熱休克蛋白－腫瘤抗原肽，所以對腫瘤的殺傷作用可能是熱休克蛋白－腫瘤抗原肽激發了外周血淋巴細胞活性，提高了對腫瘤細胞的殺傷效果。但其確切的殺傷機制有待于進一步研究。

［1］司徒鎮強，吳軍正主編.細胞培養［M］.第1版.西安：世界圖書出版西安公司，1996：186－187.

［2］Tutar L，Tutar Y.Heat shock protein：an overview［J］.Curr Pharm Biotechnol，2010，11（2）：216.

［3］Li Z，Srivastava PK.Tumor rejection antigen Grp94is an ATPase：implication for protein folding and antigen presentation［J］.EMBO J，1993，12：3143.

［4］Dressel R，Elsner K，Quentin T，et al.Heat shock protein 70is able to prevent heat shock－induced resistance of target cells in CTL［J］.J Immunol，2000，164（5）：2362.

［5］Nishikawa M，Takemoto S，Takakura Y.Development of heat shock protein with controlled distribution properties and their application to vaccine delivery［J］.Yakugaku Zasshi，2007，127（2）：293.

［6］Udono H，Srivastava PK.Comparison of tumor－specific immunogenicities of stress－induced proteins gp96，hsp90and hssp70［J］.J Immunol，1994，152：5398.

［7］Blachere NE，Udonn H，Janetazkis，et al.Heat shock protein vaccines against cancer［J］.J Immunotheraphy，1993，14：352.

2013－08－16）

1007－4287（2014）07－1061－02

＊通訊作者