骨形態發生蛋白－7通過TGFβ／smad信號通路抑制高糖誘導下足細胞的轉分化

徐建偉，劉麗秋＊，趙小麗

（1.青島市第八人民醫院腎內科，青島266100；2.青島大學醫學院，青島266021）

骨形態發生蛋白－7通過TGFβ／smad信號通路抑制高糖誘導下足細胞的轉分化

徐建偉1，劉麗秋1＊，趙小麗2

（1.青島市第八人民醫院腎內科，青島266100；2.青島大學醫學院，青島266021）

目的 通過觀察骨形態發生蛋白－7（BMP－7）對高糖環境培養下足細胞p－smad2／3、nephrin、desmin表達的影響探討BMP－7抑制足細胞轉分化機制。方法 以體外培養的小鼠永生化足細胞為研究對象，將其分為以下4組：正常糖組（NG組，含D－葡萄糖5.5mmol／L）、高糖刺激組（HG組，含D－葡萄糖30mmol／L）、高糖＋BMP－7干預組（BMP－7組，含D－葡萄糖30mmol／L＋400ng／ml rhBMP－7）、甘露醇對照組（MN組，含D－葡萄糖5.5mmol／L＋甘露醇24.5mmol／L），各組干預時間為48h，應用熒光定量PCR法檢測足細胞nephrin、desmin mRNA表達量，Western blot檢測足細胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表達量。結果 正常狀態下足細胞高表達nephrin，少量表達psmad2／3、desmin；高糖刺激可以上調足細胞p－smad2／3、desmin的表達、下調nephrin的表達（P＜0.05）；BMP－7與高糖共同培養在一定程度上可以抑制高糖引起的足細胞p－smad2／3表達上調，減少desmin表達，恢復nephrin表達（P＜0.05）；NG組與MN組之間比較p－smad2／3、nephrin、desmin表達水平無顯著差異（P＞0.05）。結論 BMP－7可能通過調節TGFβ／smad信號通路抑制高糖誘導足細胞轉分化。

足細胞；上皮細胞－間充質細胞轉分化；骨形態發生蛋白－7；TGFβ／smad信號通路；糖尿病腎病

（Chin J Lab Diagn，2014，18：1069）

研究已證實高糖能介導腎小管上皮細胞發生上皮－間充質轉分化（EMT），促進腎臟纖維化發展。在多種細胞EMT過程中，轉化生長因子β（TGF－β）被認為是最重要的誘導因子［1］，研究發現高糖環境可以誘導腎臟內TGF－β活性增強。骨形態發生蛋白－7（BMP－7）是TGF－β的拮抗劑，具有強大的抗纖維化作用，研究發現BMP－7可以阻斷TGF－β對腎小管上皮細胞EMT的促進作用，延緩糖尿病腎病（DKD）的發展［2］。本研究通過觀察BMP－7對高糖環境培養下足細胞p－smad2／3、nephrin、desmin表達的影響探討BMP－7抑制足細胞轉分化的機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 RPMI－1640培養基、胰蛋白酶、胎牛血清（美國hyclone公司），重組小鼠γ－干擾素、重組人BMP－7（美國Peprotech公司），Trizol試劑（美國invitrogen公司），逆轉錄試劑盒，Premix ExTaq（日本Takara公司），兔抗p－smad2／3抗體（美國cell signaling technology公司），兔抗nephrin抗體、兔抗desmin抗體、兔抗GAPDH抗體、HRP標記山羊抗兔IgG（中國博奧森公司）。

1.2 足細胞的培養與分組 小鼠永生性足細胞系由美國愛因斯坦大學Peter Mundel教授惠贈。足細胞復蘇后于含10%胎牛血清，10U／mlγ－干擾素的RPMI 1640培養液中，在33℃，5%CO2細胞培養箱中培養，隔天換液。后轉入不含γ－干擾素的10%胎牛血清1640培養液中，37℃培養10－14天，待細胞分化成熟后使用。將分化成熟的細胞接種于25cm2的培養瓶中，待細胞長至70－80%融合時，于無血清的培養液中饑餓24h使細胞同步化。根據實驗目的將足細胞分為4個組：正常糖組（NG，含D－葡萄糖5.5mmol／L）、高糖刺激組（HG，含D－葡萄糖30mmol／L）、高糖＋BMP－7干預組（BMP－7，含D－葡萄糖30mmol／L＋400ng／ml rhBMP－7）、甘露醇對照組（MN，含D－葡萄糖5.5mmol／L＋甘露醇24.5mmol／L），各組干預時間為48h。

1.3 熒光定量PCR 按照Trizol試劑說明書提取各組細胞總RNA，然后利用260nm的吸光度測定OD值和RNA的濃度，按照RT－PCR試劑盒說明書進行逆轉錄合成cDNA。逆轉錄條件：37℃15 min，85℃5s。按照SYBR Premix Ex Taq說明書在Light Cycler Real Time PCR擴增儀上進行SYBR Green I實時定量PCR反應，反應條件為：95℃30s預變性，然后95℃5s，60℃30s重復40個循環（引物序列及產物長度見表1）。每個樣品設2個復孔，同時設無模板陰性對照。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，確定產物特異性。以GAPDH為內參基因，以正常糖組為對照組，采用2－△△CT法對nephrin、desmin mRNA表達量進行相對定量，△△Ct＝（Ct目的基因－－Ct管家基因）實驗組－（Ct目的基因－Ct管家基因）對照組。

表1 目的基因引物序列及其擴增產物大小

1.4 Western blot 收集各組細胞，提取蛋白于95℃變性5min。取上清，各組蛋白和marker分別上樣，10%SDS－聚內烯酰胺凝膠電泳分離后轉移至硝酸纖維素膜上，用含5%脫脂奶粉封閉后以兔抗psmad2／3、nephrin、desmin、GAPDH多克隆抗體分別4℃孵育過夜（分別按1∶500、1∶200、1：200、1：1000稀釋）。洗膜后用辣根過氧化物酶標記的二抗（1∶8 000）室溫孵育1h，ECL顯影，凝膠成像系統分析，Quantity One 4.6.2掃描其光密度值，以psmad2／3、nephrin、desmin條帶與內參GAPDH條帶的光密度值之比值代表其蛋白的相對含量。

1.5 統計學分析 以上實驗均重復3次，數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，采用SPSS17.0統計軟件進行分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 BMP－7干預對高糖刺激足細胞nephrin、desmin mRNA表達的影響

實時定量PCR結果顯示，與NG組相比，HG組足細胞desmin表達明顯上調，為NG組的4.03倍，而nephrin表達則明顯下調，為NG組的0.37倍（P＜0.05）；BMP－7與高糖共培養可以減少高糖引起的足細胞nephrin、desmin的異常表達，（P＜0.05）；MN組與NG組相比較足細胞nephrin、desmin mRNA表達水平無顯著差異（P＞0.05）（表2，圖1）。

表2 各處理組足細胞nephrin、desmin mRNA的相對表達（ˉx±s，n＝3）

2.2 BMP－7干預對高糖刺激足細胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表達的影響

Western blot結果顯示，NG組足細胞低表達p－smad2／3、desmin，高表達nephrin；與NG組相比，HG組足細胞p－smad2／3、desmin蛋白表量達明顯增加，nephrin蛋白表達量則明顯減少（P＜0.05）；與HG組相比，BMP－7組足細胞nephrin蛋白表達量增加，p－smad2／3、desmin蛋白表達量減少（P＜0.05），但與NG組相比仍有差異（P＜0.05）；NG組與MN組相比，足細胞p－smad2／3、nephrin、desmin蛋白表達量無顯著差異（P＞0.05）（圖2－4）。

圖1 各處理組足細胞nephrin、desmin mRNA的相對表達（實時定量PCR）

圖2 各處理組足細胞p－smad2／3蛋白的相對表達（Western blot）

圖3 各處理組足細胞nephrin蛋白的相對表達（Western blot）

圖4 各處理組足細胞desmin蛋白的相對表達（Western blot）

3 討論

近年來有實驗研究證實，DKD的發生發展過程中可伴隨足細胞表型的改變。柏鳳等［3］通過高糖刺激體外培養的足細胞，證實高糖能夠誘導足細胞α－SMA和FN表達，并降低CD2AP和WT－l表達，提示高糖可能通過誘導足細胞發生EMT。Yamaguchi等［4］發現在DKD患者尿中丟失的足細胞非凋亡狀態，且足細胞表達成纖維細胞特異蛋白－1（FSP－1），表明足細胞發生EMT，從而自GBM脫落。本研究通過體外高糖環境下培養足細胞，觀察到高糖刺激下調足細胞nephrin表達，上調desmin表達，進一步證實了高糖可以誘導足細胞發生EMT。

腎臟EMT機制的研究目前多集中于腎小管上皮細胞，其中，TGFβ／smad信號通路是介導腎臟纖維化最重要的信號轉到途徑［5］。DKD時，腎臟TGFβ1表達增加并激活其下游smad2、smad3，后者磷酸化后結合samd4并轉入核內，介導腎小管上皮轉分化及腎臟纖維化發展［6］。BMP－7又稱骨調素－1（OP－1），屬于骨形態發生蛋白亞家族（BMPs）。BMP－7最早被認為是誘導骨生成，隨后基因敲除實驗證實了其在腎臟發育中的重要作用［7］。近年發現BMP－7是體內一種強有力的抗纖維化因子，多項研究明確證實對慢性腎損傷的不同動物模型給予重組人骨形態發生蛋白－7（rhBMP－7）能夠減少腎纖維化，改善腎功能［8］。研究發現BMP－7在系膜細胞和小管上皮細胞中可以通過拮抗TGFβ信號改善腎臟纖維化［9，10］。后來，Wang等［11］通過基因轉染的技術研究發現，BMP－7可抑制DKD大鼠足細胞數量的減少及足細胞的nephrin蛋白表達水平的降低，減少腎間質膠原Ⅰ的沉積、纖維連接蛋白（FN）的表達，同時減輕尿蛋白和腎小球纖維化，提示BMP－7可逆轉足細胞EMT，在DKD中發揮腎臟保護作用。本研究中BMP－7與高糖共培養足細胞48h可以有效減輕高糖誘導的nephrin表達下調和desmin過表達，提示BMP－7可以抑制高糖誘導的足細胞EMT。本研究還發現，高糖環境中足細胞psmad2／3信號活化，提示存在TGFβ／samd信號通路的激活，而BMP－7與高糖共培養可以抑制psmad2／3表達，在一定程度上拮抗高糖引起的TGFβ／samd信號通路的活化，這可能是BMP－7抑制高糖誘導足細胞EMT的重要機制。需要注意的是，高糖環境下足細胞內還存在著其他信號通路的活化，如Integrin／ILK通路、Wnt／β－catenin通路等，這些通路組成錯綜復雜的網絡系統，并在不同層面相互作用，共同調控EMT過程。

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Effect of BMP－7 on podocyte Epithelial－Mesenchymal Transition induced by high glucose via TGFβ／smad signal pathway

XU Jian－wei，LIU Li－qiu，ZHAO Xiao－li.
（The Eighth People’s Hospital of Qingdao，Qingdao 266100，China）

Objective To investigate the effect of BMP－7on p－smad2／3expression and epithelial－mesenchymal transition in mice podocyte induced by high glucose.Methods Cultured mice podocyte cells were randomly divided into four groups：normal glucose group（NG，D－glucose 5.5mmol／L），high glucose group（HG，D－glucose 30mmol／L），BMP－7 group（BMP－7，D－glucose 30mmol／L＋rhBMP－7 400ng／ml），mannitol control group（MN，D－glucose 5.5mmol／L＋mannitol 24.5mmol／L）.Cells of different groups were harvested after treatment of 48hours.The mRNA expressions of nephrin and desmin in podocyte were detected by RT－PCR and the protein expressions of p－smad2／3、nephrin and desmin were detected by Western blot.Results After treatment with high glucose for 48h，the expressions of psmad2／3and desmin were up－regulated while the expression of nephrin was decreased（P＜0.05）.BMP－7alleviated the changes of expressions of p－smad2／3、nephrin and desmin in podocyte induced by high glucose significantly（P＜0.05）.There was no significant differences between NG group and MN group（P＞0.05）.Conclusion BMP－7can inhibit EMT in podocyte induced by high glucose possibly via TGFβ／smad signal pathway.

podocyte；epithelial－mesenchymal transition；BMP－7；TGFβ／smad signal pathway；diabetic kidney disease

Q786

A

2013－07－26）

1007－4287（2014）07－1069－04

＊通訊作者