Clusterin在慶大霉素誘導的急性腎損傷大鼠模型中的表達及診斷意義

耿嘉男，孫 波，劉 凱，陳艷芳，劉 暢，雷冬艷，石 艷，于曉艷

（吉林大學藥學院，吉林長春130021）

Clusterin在慶大霉素誘導的急性腎損傷大鼠模型中的表達及診斷意義

耿嘉男，孫 波，劉 凱，陳艷芳，劉 暢，雷冬艷，石 艷，于曉艷＊

（吉林大學藥學院，吉林長春130021）

Clusterin是體內一種異二聚體糖蛋白，最初見于公羊睪丸液，作用為促細胞聚集。其后陸續研究發現Clusterin參與許多重要生理過程：細胞周期調控、DNA的損傷修復和組織修復等，具有輔助生殖、脂質轉運、抑制補體介導的細胞免疫等功能［1］，還與調控細胞凋亡有關［2］。為進一步明確尿中Clusterin水平與在急性腎損傷中的診斷意義［3，4］，本研究建立大鼠慶大霉素急性腎損傷模型，動態監測大鼠尿液中Clusterin的分泌水平，觀察其與腎臟病理形態學改變的關系，為將尿液Clusterin含量檢測應用于無創性腎損傷診斷提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠抗Clusterin單克隆抗體購自R＆D公司，通用型二步法免疫組化試劑盒（PV－6000）和DAB顯色劑購自北京中杉生物技術有限公司，慶大霉素購自Sigma公司。

1.2 實驗動物及建立模型

40只雄性Wister大鼠（體重180－220g，由吉林大學實驗動物中心提供），適應性飼養1周，大鼠造模前禁食12h后皮下注射慶大霉素（GM）400mg·kg·d，連續注射2天，建立GM中毒性急性腎小管壞死（ATN）動物模型，對照組大鼠皮下注射生理鹽水代替慶大霉素。大鼠置代謝籠每天收集尿液，共收集10天，置－80℃保存備用；分別于第0d、1d、 3d、5d和第9d取模型大鼠腎臟備用。

1.3 ELISA檢測大鼠尿液Clusterin水平

大鼠尿液離心后取上清，尿樣按85μl包被液＋15μl樣品比例加入96孔酶標板，4℃包被過夜；次日每孔加入150μl 1%BSA置37℃條件下封閉1h，洗板3次×3min，然后加入小鼠抗Clusterin單克隆抗體（1∶1000稀釋）100μl／孔，37℃孵育1h；洗板，加入羊抗小鼠二抗（1∶3 000稀釋）100μl／孔，孵育1h；采用鄰苯二胺－過氧化氫顯色系統進行顯色，置37℃避光顯色10min后終止反應，經酶標儀檢測A490值。

1.4 免疫組化檢測大鼠腎臟Clusterin表達

大鼠處死后取腎臟，于10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋，切片；切片經脫蠟、水化，微波熱修復，冷卻后經3% H2O2滅活內源性過氧化酶；Clusterin一抗以1∶100稀釋后加入，4℃孵育過夜，滴加二抗以及染色步驟嚴格按照PV－6000說明書操作。Clusterin蛋白陽性染色見于胞質，陽性細胞染色程度按0－3分計算：0分，陽性細胞表達＜10%；1分，陽性表達占11%－25%；2分，陽性表達占26%－50%；3分，陽性表達≥50%［5］。染色后同時觀察腎小管間質病理改變。

1.5 統計學分析

實驗數據以均數±標準差（ˉx±s）表示，采用SPSS 19.0統計軟件對數據進行分析，組間比較采用方差分析，P＜0.05時視為有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠尿液中Clusterin表達

經檢測大鼠造模第0d尿液即正常尿液Clusterin的A490值為0.56±0.25，造模后第1－2d尿液中Clusterin即有所增高（依次為0.64±0.21和0.72±0.30），但無明顯統計學意義，表明大鼠造模后1－2d尿液中Clusterin即開始有所表達，自造模后第3－7d尿液中Clusterin均較正常尿液表達明顯升高（依次為0.82±0.31、0.94±0.29、0.94±0.31、0.94±0.28、0.87±0.36），造模后第8d尿液Clusterin含量有所下降（0.75±0.28），但仍維持在較高水平，造模后第9d尿液Clusterin含量下降近正常水平（0.56±0.22）。結果表明給大鼠予慶大霉素后1－2d尿液中Clusterin即開始出現，第3d開始含量明顯增加，第4－6d達到高峰，第7－8d開始Clusterin含量趨于下降，但仍高于正常水平，造模后第9d尿液Clusterin含量接近正常。

2.2 各組大鼠腎臟病理學檢查

細胞質呈現黃色顆粒即為Clusterin蛋白陽性表達，免疫組化結果顯示：正常組大鼠腎臟無明顯病理改變，無明顯Clusterin蛋白表達，免疫組化評分為0分；造模成功后1d Clusterin偶有表達，評分為1分，病理可見炎癥細胞浸潤；第3d、5d時Clusterin表達最多，評分為3分，腎間質炎癥細胞浸潤明顯，可見腎小管上皮細胞壞死、塌陷，腎間質明顯增寬，間質水腫明顯；第9d時炎癥細胞浸潤有所減輕，Clusterin表達開始減少，評分為2分，見圖1。

圖1 正常組及模型組大鼠腎臟Clusterin表達（免疫組化，×200）

3 討論

急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是可發生在各種臨床情況下的一種復雜的腎功能減退綜合征，2013年3月14第八個世界腎臟日就提出“關注AKI的防治”，有流行病學統計表明20%的AKI由濫用藥物引發［6］，我國每年有近400萬人患上AKI，而人們對其認知相對較少，若不及時發現并治療，極易發展為慢性腎臟疾病甚至終末期腎臟病（尿毒癥）導致死亡。傳統診斷AKI的指標有血肌酐和尿素氮等，二者敏感性和特異性都不高，且不完全依賴于腎功能，與許多非腎性因素相關［7］，如受年齡、性別、種族、肌肉、營養狀況、感染和分布容積等因素影響，血肌酐分泌水平有較大差異，尿素氮的產生和腎小管的處理、蛋白質的攝入、代謝狀態、上消化道出血、血容量和大劑量使用激素的治療等密切相關。因此尋求具有高敏感性、特異性、易檢測的新的生物標志物一直是AKI防治的研究熱點之一。

本實驗采用皮下注射慶大霉素建立中毒性急性腎小管壞死（ATN）的AKI動物模型，ELISA檢測模型大鼠尿液Clusterin含量，結果發現AKI大鼠給予慶大霉素后1－2d尿液中Clusterin即開始出現，第3d開始含量明顯增加，第4－6d達到高峰，7－8d時仍維持較高水平。而免疫組化結果表明第3d、5d時腎臟Clusterin表達最多，間質急性水腫病變最為明顯。說明尿液Clusterin含量與腎臟Clusterin含量及病變程度關聯性好，腎損傷早期尿液即有改變，而尿液檢測為無創性檢測，可避免不必要的腎組織活檢，提示可通過檢測病人尿液中是否有Clusterin分泌來預示AKI的發生。本實驗結果提示尿液Clusterin含量可作為檢測早期AKI的新的生物標志物，可應用于臨床早期診斷和藥物研究中臨床試驗的安全性監測，不僅有利于防止腎毒性藥物的過量使用，也利于AKI臨床的早期診斷及改善預后。

［1］鄒穎剛，王 歡，耿嘉男，等.Clusterin在急性腎損傷診斷中的意義［J］.中國實驗診斷學，2013，17（5）：982.

［2］Prochnow H，Gollan R，Rohne P，et al.Non－Secreted Clusterin Isoforms Are Translated in Rare Amounts from Distinct Human mRNA Variants and Do Not Affect Bax－Mediated Apoptosis or the NF－κB Signaling Pathway［J］.PloS one，2013，8（9）：e75303.

［3］Murphy BF，Kirszbaum L，Walker ID，et al.SP－40，40，a newly identified normal human serum protein found in the SC56－9complex of complement and in the immune deposits in glomerulonephritis［J］.J Clin Invest，1988，81（6）：1858.

［4］Rosenberg M E，Dvergsten J，Correa－Rotter R.Clusterin：an enigmatic protein recruited by diverse stimuli［J］.J Lab Clin Med，1993，121（2）：205.

［5］吳 丹.腎小管上皮細胞表型轉化與移植腎纖維化的相關性［D］.吉林大學，2013.

［6］Crowley S T，Peixoto A J.Acute kidney injury in the intensive care unit［J］.Clinics in chest medicine，2009，30（1）：29.

［7］李一飛，姚廣濤.急性腎損傷中腎小管損傷標志物的研究進展［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，17（23）：279.

2013－11－20）

1007－4287（2014）07－1072－02

吉林省科技發展計劃資助項目（科技支撐計劃20120962）；吉林大學開放性創新實驗項目（2013B73337）；吉林省衛生廳資助項目（2013Z101）

＊通訊作者