超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用分析清熱涼血方中的化學成分*

鹿見香趙 鐵 曾偉賢 馬雪婷 呂景晶 白彥萍△

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用分析清熱涼血方中的化學成分*

鹿見香1趙 鐵2曾偉賢1馬雪婷1呂景晶1白彥萍2△

（1.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，北京 100029）

目的鑒定中藥復方清熱涼血方浸膏中成分，為其治療銀屑病的物質基礎提供科學依據。方法采用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用（LC-ESI-QTOF MS）儀分析。色譜柱：5 cm×2.1 mm，1.7 μm BEH C18柱，流動相為0.1％的甲酸溶液（A）-0.1％乙腈溶液（B），流速為0.3 mL/min。采用負離子模式與方中主要的單味藥對比判斷色譜峰的來源藥材，繼而通過與來源藥材化學成分進行精確分子量的對比鑒定化合物。結果 樣本中檢測出30多種物質，共鑒定出22個中藥成分，分別為檸檬酸/異檸檬酸（1）、沒食子酸（2）、Mudanoside B（3）、兒茶素（6）、羥基芍藥苷（7）、短葉蘇木酚酸（8）、丹皮酚（10）、牡丹酚新苷（12）、白芍苷 R1 （13）、芍藥苷（14）、鞣花酸（15）、沒食子酰芍藥苷（16）、五沒食子酰葡萄糖苷（17）、Oldenlandoside I（18）、苯甲酰氧芍藥苷（19）、牡丹皮苷C（20）、苯甲酰芍藥苷（24）、三羥基-十八碳二烯酸（25）、Anguivioside B1/2（26）、三羥基-十八碳二烯酸/9-羥基十八烷二酸（29）、2-羥基-3-甲基蒽醌（30）。結論在清熱涼血方主要化學成分中，丹皮酚、芍藥苷、白芍苷R1與銀屑病的發(fā)病機理相關，可能是其活性成分。

清熱涼血方 銀屑病 超高效液相色譜-飛行時間質譜（LC-ESI-QTOF MS） 化學成分

清熱涼血方（又名祛銀顆粒）是本文通信作者白彥萍教授根據中醫(yī)理論結合銀屑病（血熱型）的特點和現(xiàn)代藥理學研究的自擬方藥。該方以犀角地黃湯為基礎加減而成，清熱涼血解毒中藥為其主要成分，其良好的臨床療效已通過前期的臨床及動物模型研究得到證實［1］。為揭示清熱涼血方的臨床療效物質基礎，為其安全有效應用提供科學依據，本研究采用超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用（LC-ESI-QTOF MS）技術，利用超高效液相色譜優(yōu)良的分離效能，結合飛行時間質譜提供的準確分子量，對這一制劑中的化學成分進行全面的分析。現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 儀器 超高效液相色譜-飛行時間質譜聯(lián)用儀［美國Waters公司Acquity超高效液相色譜系統(tǒng)、高壓二元梯度泵（Binary Solvent Manger）、恒溫自動進樣器（SampleManger）、柱溫箱、電噴霧離子源（ESI）、四級桿飛行時間質譜儀（Bruker公司QTOF-MS）、Hystar工作站］。色譜柱：5 cm×2.1mm，1.7μm BEHC18柱（Waters，USA）。工作站為MassLynx V4.1軟件（美國Waters公司）

1.2 藥物與試劑 清熱涼血方組方為土茯苓、生地黃、赤芍、牡丹皮、白花蛇舌草等；所有藥材均經主管中藥師鑒定。標準品：沒食子酸（批號0831-9501）、兒茶素（批號877-200001）、丹皮酚（批號0708-9704）均購買自中國生物制品檢定所，純度為98％。高效液相色譜-梯度甲酸購買CNW公司（Dusseldorf，Germany）。甲醇、乙腈 （色譜純，購買于Fisher公司），MilliQ水由Elix純水系統(tǒng)及Millipak-20 Filter Unit處理。

1.3 色譜條件 高效液相色譜柱（Waters，USA）色譜柱為 5 cm×2.1 mm，1.7 μm BEH C18色譜柱 （Waters，USA），柱恒溫40℃，以超純水與0.1％甲酸銨為A相，乙腈為B相。按如下設置進行梯度洗脫：0～3 min，5％～50％B；3～10 min，50％～70％B；10～15 min，70％～100％ B，100％B保持5 min。流速0.3 mL/min。4℃自動進樣1μL。色譜分析在WatersACQUITYUPLC系統(tǒng)上進行。

1.4 質譜條件 采用電噴霧離子源（ESI）模式（負離子電壓2.5 kV、正離子3 kV），離子源溫度110℃，錐形流速為30 L/h，脫溶劑氣流速600 L/h，加熱毛細管溫度300℃。錐孔電壓40 V。質譜分析在動態(tài)范圍擴展W光學模式12000分辨率。用濃度2μg/mL、流速20μL/min亮氨酸腦啡肽作為質量數、噴射頻率10 s，正負離子質量的掃描范圍均為50～2000 m/z。

1.5 樣品處理 清熱涼血方中各藥味均各取50 g加10倍體積清水煎煮2次，合并水煎液加水稀釋，12000轉/min，離心5 min，所得上清液經0.22 μm濾膜過濾后取1 μL進行UPLC-ESI-QTOF MS分析。

2 結果

2.1 鑒定清熱涼血方中成分 清熱涼血方主要組成藥材典型總離子流（TIC）色譜圖復方樣本的正、負極模式見圖1。由圖1可見負離子模式下檢測到的化學成分比正離子模式下物質多，提示本復方中可能含有較多的有機酸。UPLC-QTOFMS分析復方樣本中檢測到超過30種相對較多物質。其中22種物質根據其保留時間、文獻數據準分子離子精確m/z和功能片段鑒定為檸檬酸/異檸檬酸（1）、沒食子酸（2）、Mudanoside B（3）、兒茶素（6）、羥基芍藥苷（7）、短葉蘇木酚酸（8）、丹皮酚（10）、牡丹酚新苷（12）、白芍苷 R1（13）、芍藥苷（14）、鞣花酸（15）、沒食子酰芍藥苷（16）、五沒食子酰葡萄糖苷（17）、Oldenlandoside I（18）、苯甲酰氧芍藥苷（19）、牡丹皮苷C（20）、苯甲酰芍藥苷（24）、三羥基-十八碳二烯酸（25）、Anguivioside B1/2（26）、三羥基-十八碳二烯酸/9-羥基十八烷二酸（29）、2-羥基-3-甲基蒽醌（30）。部分化學結構展示在圖2中。

圖1 正負離子模式下湯劑成分的總離子圖

圖2 清熱涼血方部分成分的化學結構式

2.2 清熱涼血方中成分化學式的鑒定 對制劑中色譜峰的鑒別主要依據精確分子量及來源藥材進行。具體方法如下：首先，根據［M-H］-/［M-H+Cl］-/［2M-H］-陰極和/或［M+H］+/［M+NH4］+/［M+Na］+在陽極離子峰。在此步驟中，樣本成分響應值較高負極應用的較多。第2步，計算各成分精確的化學式，例如可接受的精確閾值、氮原子數量的通常規(guī)則、DBE指數、顯示同位素功能。第3步，根據化學式查詢天然產品字典、化學目錄等化學數據庫。通過檢索數據庫Dictionary of Natural Products中對應藥材的化學成分，將待鑒定色譜峰的精確分子量及分子式與數據庫中記載的化學成分精確分子量及分子式進行匹配，從而對色譜峰進行鑒別。同時，文獻中報道與碎片離子相吻合。丹皮酚、沒食子酸、兒茶素、芍藥苷等通過與標準品的保留時間和質譜碎片比對確定。結果見表1。

3 結論

中藥清熱涼血方在臨床上治療銀屑病效果良好［1］。本研究利用LC-ESI-QTOF MS系統(tǒng)的高分離度及精確分子量信息，并結合色譜峰藥材來源的分析與藥材化學成分數據庫的檢索，達到了對制劑中主要成分的有效分析和鑒別［2-3］，LC-ESI-QTOF MS技術能夠以質譜碎片信息推定化合物結構，此優(yōu)勢成為中藥等復雜體系成分分離分析及化合物結構鑒定的主要方法［4］。本研究應用此方法研究了清熱涼血方的化學成分。首次初步檢測到超過30種化合物，確定了22個，為今后清熱涼血方的質量控制、穩(wěn)定其療效、闡明其作用的物質基礎提供了科學依據。

銀屑病的發(fā)病特征為角朊細胞增殖和分化異常，伴隨顯著的炎癥反應。傳統(tǒng)篩選抗銀屑病藥的療效目標主要集中在抗增殖、促分化和抗炎癥3個方面。在本研究中鑒定的成分中，已有研究表明從白芍中提取的有效組分白芍總苷（TGP）具有雙向免疫調節(jié)作用，并具有抗炎、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗病毒等多種藥理作用［5］。白芍苷RI（AR1）是從白芍中提取出的一種新的單枯苷類化合物，白芍苷R對J774巨噬細胞的增殖表現(xiàn)出較強的抑制作用［6］。白芍苷R1對HeLa細胞、K562兩種癌細胞株的增殖也表現(xiàn)出一定的抑制作用。丹皮酚作為牡丹皮的主要藥用成分，具有鎮(zhèn)靜、催眠、抗菌、抗炎、抗氧化、降血壓、抗過敏、抗病毒等作用［7-9］，丹皮酚制成的軟膏臨床上具有治療皮膚病的良好療效［10-12］，丹皮酚軟膏可降低毛細血管通透性，抑制炎癥，對Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型變態(tài)反應均有抑制作用［13］；其對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大腸埃希菌抑菌作用最強，其次是傷寒桿菌和乙型副傷寒桿菌，對變形桿菌作用較弱［14］；牡丹皮水提物和醇提物都有一定的抑菌作用，水提物抑菌作用較醇提物強［15］，從側面證明其對銀屑病的炎癥部分的作用。本實驗結果顯示，清熱涼血方中的成分復雜，各成分的相互作用，可以多方面達到治療目的，從而顯示出中藥復方多靶點治療疾病的優(yōu)勢。

本結果為進一步開展細胞和分子生物學實驗探討清熱涼血方作用分子機制提供線索，也為清熱涼血方處方優(yōu)化和質量標準的建立提供參考。值得注意的是，面對清熱涼血方中的復雜的化學成分，本研究顯然是遠遠不夠的，需要進一步對未知更多的化學成分進行分析鑒別。

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Chem ical Constituents of Heat-clearing and Blood-cooling Decoction Analysed by LC-ESI-QTOF MS

LU Jian-xiang，ZHAO Tie，ZENG Wei-xian，et al. Beijing University of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100029，China

Objective：To identify non-target compounds in heat-clearing and blood-cooling Decoction samples and to provide scientific basis for Heat-clearing and blood-cooling Decoction treating psoriasis.M ethods：Ultra Performance Liquid Chromatography system equipped with a 5 cm×2.1 mm，1.7 μm BEH C18column was used in this study.The column，constant at 40℃，was eluted with a linear gradient of 5％～50％B over 0～3 min，50％～70％B over 3～10 min，70％～100％B over 10～15 min，the composition was held at 100％B for 5 min，where A= water with 0.1％ammonium formate and B=acetonitrile.The flow rate was 0.3 mL/min.Injection volume was 1 μL for both positive ion mode（ES+）and negative ion mode（ES-）.The mass spectrometric data of full scan mode was collected by using a Xevo G2 QT of MS.Results：More than 30 components were detected with relatively high abundance from the soup sample by UPLC-QTOFMS analysis.Among them，22 components were identified as citric acid（1），gallic acid（2），mudanoside B（3），catechin（6），oxypaeoniflorin（7），brevifolin carboxylic acid（8），paeonol（10），apiopaeonoside（12），albiflorin R1（13），paeoniflorin（14），ellagic acid（15），galloylpaeoniflorin（16），pentagalloyl glucose（17），oldenlandoside I（18），benzoyloxypaeoniflorin（19），mudanpioside C（20），benzoylpaeoniflorin（24），trihydroxy-octadecadienoic acid（25），anguivioside B1/2（26），trihydroxy-octadecenoic acid/9-Hydroxyoctadecanedioic acid（27），trihydroxy-octadecenoic acid/9-hydroxyoctadecanedioic acid（29），and 2-hydroxy-3-methylanthraquinone（30）.Conclusion：Paeonol，paeoniflorin and albiflorin R1 may contribute to heat-clearing and blood-cooling Decoction.

Heat-clearing and blood-cooling Decoction；Psoriasis；LC-ESI-QTOF MS；Chemicals

R287

A

1004-745X（2014）04-0565-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.001

國家自然科學基金資助項目（No.81173270）；北京市自然科學基金資助項目（No.7112122）

△通信作者

表1 清熱涼血方部分成分鑒定結果

2013-11-21）