滅幽湯對Hp相關性胃炎“脾胃濕熱證”模型小鼠HSP70表達的影響*

喻 斌 羅 燕 郭 璇 王小娟△ 杜中華 尹 姣 徐 寅 夏 蓉

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410007）

滅幽湯對Hp相關性胃炎“脾胃濕熱證”模型小鼠HSP70表達的影響*

喻 斌1羅 燕2郭 璇2王小娟1△杜中華2尹 姣2徐 寅1夏 蓉2

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫藥大學，湖南 長沙410007）

目的觀察滅幽湯對Hp相關性胃炎“脾胃濕熱證”模型小鼠熱休克蛋白70（HSP70）蛋白及其mRNA的影響。方法采用復合因素（肥甘食物+濕熱環境+幽門螺桿菌）建立BALB/c小鼠Hp相關性胃炎“脾胃濕熱證”模型，造模成功后將小鼠隨機分為5組：高濃度滅幽湯組、低濃度滅幽湯組、胃三聯組（替硝唑+克拉霉素+枸櫞酸鉍鉀顆粒）、模型組、對照組。連續給藥14 d后，分別采用Western Blot和qPCR檢測HSP70蛋白、HSP70 mRNA的表達情況。結果HSP70蛋白及其mRNA的表達：BALB/c小鼠模型組與對照組比較，HSP70蛋白、HSP70 mRNA表達均增加（P＜0.01）；與模型組比較，高、低濃度滅幽湯組，胃三聯組小鼠HSP70蛋白、HSP70 mRNA表達均增加（P＜0.01）；胃三聯組與高、低濃度滅幽湯組中HSP70蛋白HSP70 mRNA表達均增加（P＜0.05）。結論滅幽湯可能通過上調HSP70蛋白及其mRNA表達而發揮治療Hp相關性胃炎的作用。【關鍵詞】 滅幽湯 Hp相關性胃炎“脾胃濕熱證” HSP70蛋白 HSP70 mRNA

研究表明，Hp是引起胃炎、消化性潰瘍和胃癌的主要因素［1-4］。熱休克蛋白（HSPs）是生物體受到生物、物理、化學、精神等刺激時發生應激反應而合成的高度保守的蛋白質，HSP70是熱休克蛋白中最重要的一種蛋白質，具有分子伴侶、抗氧化、抗細胞凋亡和免疫調節等功能。滅幽湯是臨床治療Hp相關性胃炎“脾胃濕熱證”的有效復方［5-9］。本研究在前期基礎上，進一步從HSP70蛋白、HSP70 mRNA角度探尋滅幽湯治療Hp相關性脾胃濕熱證慢性胃炎的機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 動物 BALB/c小鼠70只，SPF級，雌雄各半，體質量（20±5）g，購自南京君科生物科技有限公司，質量合格證號：SCXK（蘇）2011-0003。小鼠購進后常規飼養，室溫（20±1）℃，照明晝夜交替時間為12∶12，自由飲水、進食，適應性喂養3 d，飲食、飲水正常者，無不良反應，即納入實驗。

1.2 藥物 滅幽湯（黃芩10 g，蒲公英15 g，三七3 g，白及10 g，青皮10 g，陳皮10 g，烏賊骨10 g），以上藥材均購于湖南省藥材公司飲片加工廠，經湖南中醫藥研究院鑒定；藥物浸泡30 min后，加水沒過藥面5 cm，武火煎至沸騰后改文火，繼續煎煮20 min，取汁另置；繼續加水，煎煮沸騰后，文火續煎20 min，取汁。藥汁合并后濃縮至每毫升含生藥2 g，并用離心機去除殘渣，4℃保存。枸櫞酸鉍鉀由麗珠醫藥生產，批號1212248。替硝唑由山東魯抗醫藥集團賽特有限責任公司生產，國藥準字H20033090，生產批號121004。克拉霉素由杭州中美華東制藥有限公司生產，國藥準字H10970216，生產批號121101。

1.3 試劑及儀器 悉尼標準菌株（SSI），含有細胞毒素相關基因（CagA）蛋白和空泡細胞毒素（VacA），濃度為Hp菌液1×109cfu/mL，由湖南中醫藥大學基礎醫學院病原免疫學教研室提供。普通飼料由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，高糖高脂飼料（普通飼料、8％蜂蜜、12％豬油）由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司代加工。膠體金法幽門螺桿菌檢測試劑盒，艾康生物技術（杭州）有限公司生產，批號20123139。免疫組化鼠抗人HSP70-PE、mouse-IgG2a和mouseIgG-PE及BCA蛋白定量試劑盒均購自長沙維爾生物有限公司。逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司，Trizol購自Invitrogen公司，Taq酶購自Genstar公司，DEPC購自Sigma公司，dNTP購自Genstar公司。臺式冷凍離心機購自eppendorf公司，熒光定量RCP儀購自Thermo公司，電泳儀和水平瓊脂糖電泳槽購自北京六一公司。

1.4 分組與造模 將70只BALB/c小鼠按體質量隨機分為高濃度滅幽湯組、低濃度滅幽湯組、胃三聯組、模型組、對照組，每組14只。對照組予以普通飼料飼養，高濃度滅幽湯組、低濃度滅幽湯組、胃三聯組、模型組予以高脂飼料飼養10 d后放入人工濕熱箱 ［溫度（32±2）℃，濕度（95±1）％］內，繼續高脂飼料喂養，于放入人工濕熱箱后的第16日以濃度為1×109cfu/mL幽門螺桿菌混懸液0.3 mL/只灌胃。灌胃前24 h禁食不禁水，灌胃前4 h禁水，灌胃后4 h給食水。隔日感染1次，連續感染3次，感染后定植2周。2周后各組隨機抽取2只小鼠，取胃黏膜做病理切片觀察炎癥情況，模型組只取2只小鼠以膠體金法檢測血Hp抗體，取胃黏膜組織，電鏡下觀察Hp定植情況。

1.5 給藥方法 高濃度滅幽湯組、低濃度滅幽湯組、胃三聯組在模型造模成功后開始給藥，按照小鼠與人體表面積計算比值換算公式計算小鼠用藥劑量，胃三聯組小鼠用藥劑量為279.8 mg/kg，高濃度滅幽湯組用藥劑量為12.4 g/kg，低濃度滅幽湯組為6.2 g/kg。每日灌胃1次。其他組分別灌等量的蒸餾水。

1.6 標本采集與處理 給藥后2周處死所有小鼠，將BALB/c小鼠仰臥位固定于鼠板，迅速取出胃標本。取胃前，將幽門部和賁門部結扎，在兩結扎線的兩端切斷食道及十二指腸，摘下全胃。沿胃大彎剖開，用冰生理鹽水沖洗干凈后放入40 g/L多聚甲醛中4℃固定24 h，石蠟包埋，切片。（1）胃黏膜中HSP70蛋白表達檢測。①免疫組織化學分析。按照BCA蛋白定量試劑盒進行HSP70的免疫組化檢測。配制適量BCA工作液，完全溶解蛋白標準品，濃度為2 mg/mL，加用于稀釋標準品的溶液到20 μL。各孔加入200 μL BCA工作液，37℃放置30 min。測定波長，根據標準曲線計算出蛋白濃度。②western blot分析。配10％～12％分離膠，加入TEMED后立即搖勻后灌膠并用異丙醇封膠。3 min后倒去膠上層異丙醇并用吸水紙將其吸干。進行電泳，電泳后轉膜，轉膜完畢后，TBS-T沖洗1次，時間5 min。檢測蛋白轉膜的效率，用TBS-T洗凈后，用TBST配制5％脫脂奶粉封閉1 h再與HSP70一抗結合，洗膜后與二抗結合45～60 min，漂洗。ECL法檢測NC膜，以圖像分析處理系統進行圖像分析。（2）胃黏膜中HSP70 mRNA表達檢測。①胃黏膜RNA提取及樣品鑒定。將胃黏膜組織加入Trizol后充分研磨勻漿，混勻后室溫裂解3 min，加0.2倍體積的三氯甲烷震蕩，室溫下靜置3～5 min，12000 r/min離心15 min。取上層液相，加入等體積的異丙醇，-20℃靜置20 min。12000 r/min，15 min低溫離心，去上清，沉淀中加入75％乙醇1 mL，儀器震蕩。12000 rpm，5 min低溫離心，去上清，空氣干燥5～10 min后測定濃度。每個樣品配制1％變性瓊脂糖凝膠電泳，泳畢，凝膠成像系統下觀察。②RNA逆轉錄。以組織中mRNA為模板進行逆轉錄反應，逆轉錄cDNA，反應條件：70℃加熱5min，然后37℃加熱5min，最后42℃加熱1 h 30 min；72℃反應10 min，所得cDNA于-20℃凍存。③QRT-PCR反應。反應體系：Template 3 μL，Primer A（10 μM）1.5 μL，Primer B（10 μmol/L）1.5 μL，PCR H2O9 μL，2X SYBGREEN PCR Master Mix 15 μL。反應條件：95℃ 10 min，然后95℃ 5 s，56℃ 30 s，共40個循環。反應結束后通過電腦自動分析和計算得到各樣本的mRNA表達量。

1.7 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件。計量資料以（±s）表示，符合正態性和方差齊性的資料，采用完全隨機化設計的方差分析、多重比較；不符合正態性和方差齊性，用秩和檢驗Kruskal-Wallis H檢驗，兩組比較用Wilcoxon檢驗和Mann-Whitney U檢驗。P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組小鼠胃組織病理改變 光鏡下，對照組小鼠胃黏膜上皮細胞排列整齊，細胞呈單柱狀，固有層內有密集排列的腺體，個別小鼠胃黏膜底部可見少量散在的淋巴細胞。模型組小鼠胃竇部的炎癥程度重，胃黏膜上皮排列紊亂，固有層內可見大量淋巴濾泡、嗜酸性粒細胞及中性粒細胞浸潤，炎癥細胞甚至到達黏膜下層。低濃度滅幽湯治療組炎癥程度明顯減輕，黏膜層少量炎性細胞浸潤，固有層僅有水腫，少量淋巴細胞。高濃度滅幽湯治療組和胃三聯治療組胃黏膜上皮細胞排列整齊，炎癥幾乎全部消失。

2.2 各組小鼠胃黏膜HSP70、HSP70 mRNA表達變化的比較 見表1。與對照組比較，模型組HSP70蛋白、HSP70 mRNA表達均增加（P＜0.01）；高、低濃度滅幽湯組及胃三聯組小鼠HSP70、HSP70 mRNA表達均高于模型組 （P＜0.01）；高濃度滅幽湯組HSP70、HSP70 mRNA高于低濃度滅幽湯組 （P＜0.05）；胃三聯組HSP70、HSP70 mRNA高于低濃度滅幽湯組、低于高濃度滅幽湯組，但差異均無統計學意義（P＞0.05）。

表1 各組小鼠胃黏膜組織HSP70蛋白、HSP70 mRNA蛋白表達比較（±s）

表1 各組小鼠胃黏膜組織HSP70蛋白、HSP70 mRNA蛋白表達比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.01；與低濃度滅幽湯組比較，▲P＜0.05。

組 別 n HSP70 HSP70 mRNA正常對照組 12 0.19788±0.05618 0.00083±0.00014模型組 12 0.35462±0.05644△ 0.00175±0.00023△高濃度滅幽湯組 12 0.64513±0.10416*△▲0.00421±0.00034*△▲低濃度滅幽湯組 12 0.54075±0.10125*△ 0.00390±0.00029*△胃三聯組 12 0.57950±0.10272*△ 0.00407±0.00035*△

3 討論

HSP70是HSP家族中表達最多，也是最重要的可誘導性應激蛋白。當細胞受到各種有害應激作用時，HSP70能以多種生物活性因子形式釋放到細胞外調節機體的炎癥及免疫應答［10］。有研究表明通過上調HSP70可保護細胞，修復被損傷的前核糖體，防止溶酶體破壞、穩定細胞膜，減少Hp定植、減輕胃黏膜炎癥和維持黏膜完整，減少細胞凋亡［11-13］。此外，HSP70還可通過調控NF-κB、AP-1而間接抑制TNF-α、IL-1、IL-6等炎癥因子的分泌，減少炎癥的發生［14］。

脾胃濕熱證是脾胃病中的一個常見證型，主要是由于外感濕熱、飲食不節、情志不調等因素引起。李東垣認為濕熱的產生“皆由飲食、勞倦損傷脾胃，乘天暑而病作也”。朱丹溪亦認為“東南地土卑弱，濕熱相火為病甚多”。薛雪在《濕熱條辨》中認為“濕熱病之病因，多由脾虛失運，濕飲停聚，再受客邪，內外相引而成”。古代醫家均認為脾胃濕熱證與飲食、氣候環境等因素息息相關。研究表明，脾胃濕熱證在病理上與炎癥關系密切。Hp是一種單極、多鞭毛、末端鈍圓、螺旋形彎曲的細菌，具有極強的運動能力。強動力性是Hp致病的重要因素，可引起慢性活動性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等脾胃病。近年來，研究表明，濕熱既是Hp感染的外在因素，又是其賴以生長、繁殖的內在環境，慢性胃炎脾胃濕熱證Hp感染率最高。從發病及臨床表現上來看，Hp致病亦具有隱匿和纏綿易反復等類似濕熱的性質，同時慢性胃炎脾胃濕熱證也多表現為胃黏膜充血、水腫、局部炎癥細胞浸潤，其炎癥程度與Hp感染呈正相關［14］。

本研究表明，濕熱環境和Hp等因素的刺激可增加HSP70、HSP70 mRNA的釋放，給予清熱祛濕的中藥湯劑滅幽湯后HSP70、HSP70 mRNA明顯升高，說明通過上調HSP70、HSP70 mRNA的釋放，可提高機體免疫反應，減少黏膜細胞浸潤，進而減輕黏膜炎癥反應。由此可推測滅幽湯可能是通過增加HSP70、HSP70 mRNA的表達來治療Hp相關性脾胃濕熱證慢性胃炎。

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Effect of M ieyou Decoction on HSP70 in H.Pylori－Associated Gastritis Rats w ith Spleen-stomach Damp-heat Syndrome

YU Bin，LUO Yan，Guo Xuan，et al. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine，Hunan，Changsha 410007，China

Objective：To study the expressions of heat shock protein 70（HSP 70）and heat shock protein 70 mRNA in H.Pylori－Associated Gastritis rats with spleen-stomach damp-heat syndrome，and to investigate the mechanism of Mieyou Decoction in the treatment of chronic gastritis.M ethods：BALB/c H Pylori－Associated Gastritis rats with spleen-stomach damp-heat syndrome model were established by composite condition（fatness food+ damp-heat environment+helicobacter pylori）.After the success of modeling，the rats were random ly divided into five groups：high concentration Mieyou Decoction group，low concentrations Mieyou Decoction group，gastric triad group（Tinidazole、Clarithromycin and Bismuth potassium citrate granules），model group and normal control group. qPCR and Western Blot were used to detect the expressions of HSP70 and HSP70 mRNA after 14 days of continuous administration.Results：Expressions of HSP70 and mRNA：compared with normal control group，expressions of HSP70 and HSP70 mRNA in BALB/c rats model group significantly increased（P＜0.01）.Compared with model group，HSP70 and HSP70mRNA in high and low concentration Mieyou Decoction groups and gastric triad group increased.The differences were statistically significant（P＜0.01）.The expressions of HSP70 and HSP70mRNA in gastric triad group，high and low concentration Mieyou Decoction groups increased.The difference was not statistically significant（P＞0.05）.Conclusion：Mieyou Decoction may play a role in treatment of chronic gastritis by raising the expressions of HSP70 and HSP70mRNA.

Mieyou Decoction；H Pylori－Associated Gastritis rats with spleen-stomach damp-heat syndrome；HSP70；HSP70 mRNA

R285.5

A

1004-745X（2014）04-0589-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.011

湖南省自然科學基金項目（No.12JJ2046）；湖南省科技廳資助科研項目（No.2011SK3096）

△通信作者

2013-12-19）