加味參附顆粒對慢性心力衰竭大鼠心肌超微結構的影響*

靳利利 袁 丁 史振羽 姚 楠 王清海

（廣東省第二中醫院，廣東 廣州 510095）

加味參附顆粒對慢性心力衰竭大鼠心肌超微結構的影響*

靳利利 袁 丁 史振羽 姚 楠 王清海

（廣東省第二中醫院，廣東 廣州 510095）

目的建立大鼠心衰模型，觀察加味參附顆粒對腹主動脈縮窄法造模成功的慢性心力衰竭大鼠模型的心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、血清TNF-α及IL-6的表達和超微結構的影響。方法雄性SD大鼠50只，隨機分為正常組（不給藥）、模型組（灌胃生理鹽水）、曲美他嗪組（灌胃曲美他嗪5.4 mg/kg）、加味參附顆粒低劑量組（灌胃加味參附顆粒6.84 g/kg）、加味參附顆粒高劑量組（灌胃加味參附顆粒13.68 g/kg）各10只，采用腹主動脈縮窄法建立心衰模型。測定心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性、血清TNF-α及IL-6的表達和電鏡下觀察心肌超微結構形態。結果加味參附顆粒高、低劑量均能夠顯著提高心衰大鼠心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性，減輕心肌超微結構的損傷。結論加味參附顆粒對心衰大鼠超微結構有保護作用，其機制可能是通過慢性心衰心肌各細胞因子的表達具有重要的抑制效應，并通過調節心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性發揮作用。

心力衰竭 加味參附顆粒 超微結構

慢性心力衰竭發病率高、死亡率高，為心血管科常見病和多發病，同時其發病率和患病率也在逐年增加。加味參附顆粒是本文作者之一王清海教授研制的中藥復方制劑，臨床用于防治心力衰竭，具有明顯的臨床療效。為進一步闡明驗方加味參附顆粒的作用機制，本課題組開展了加味參附顆粒對心力衰竭大鼠超微結構影響的實驗研究，并觀察對腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和白細胞介素-6（IL-6）的影響以及探討加味參附顆粒治療慢心衰的部分可能機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠，體質量180～220 g，由廣東省醫學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（粵）2008-0002，實驗動物質量合格證號No.0100288。動物實驗環境：廣東省中醫研究所SPF級動物實驗室，設施使用許可證號SYXK （粵）2010-0059。

1.2 藥物 加味參附顆粒由紅參、附子、茯苓、葶藶子等藥物組成（廣東省第二中醫院制劑室生產，粵藥制字Z20071343，批號20120201）使用時溶于生理鹽水中，混勻后用于動物灌胃。曲美他嗪片 （山東瑞陽有限公司，國藥準字H20066534）。每次灌胃前將藥物研磨粉碎，再用蒸餾水稀釋使用。

1.3 模型制備 隨機分組為正常組、模型組、曲美他嗪組、加味參附顆粒低劑量組、加味參附顆粒高劑量組，每組10只。除正常組外，其余大鼠用氯胺酮（50 mg/kg）和地西泮（5 mg/kg）腹腔注射麻醉，麻醉后仰臥位固定，腹部剪毛、消毒，于腹部正中切開皮膚層，沿腹白線切開肌肉層。用生理鹽水紗布遮蓋創面，然后分離膈肌下腎動脈分支上的一小段腹主動脈，將棉線穿至腹主動脈下，選擇直徑1 mm軟導管置于腹主動脈上，用棉線將動脈及導管結扎在一起至完全阻斷血流后，抽出導管，結扎后的腹主動脈內徑即為導管直徑。縫合手術創面，消毒，腿部肌內注射青霉素，術后注意保暖，待動物完全清醒，送回動物房常規飼養。

1.4 給藥方法 加味參附顆粒低劑量組每日灌服6.84 g生藥/kg（等同于臨床劑量），高劑量組每日灌服13.68 g生藥/kg（等同于2倍臨床效量），曲美他嗪組予每日灌服5.4 mg/kg，模型組給同體積的生理鹽水。正常組不給藥。給藥8周。

1.5 標本采集與檢測 （1）心肌線粒體Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的測定。組織線粒體分離試劑盒，產品編號為C3606，碧云天生物技術研究所。根據每小時每毫克組織蛋白的組織中ATP酶分解ATP產生1 μmoL無機磷的量為一個ATP酶活力單位。計算公式：組織中ATPase活力=測定管OD值-對照管OD值/標準管OD值-空白管OD值×標準管濃度（0.02 μmol/mL）×6×7.8+待測勻漿蛋白濃度。（2）ELISA法檢測血清TNF-α及IL-6的表達。麻醉后大鼠腹主動脈取血，干凈促凝管中室溫凝固30 min后1000 r/min離心15 min，收集血清并分裝。按試劑盒說明書操作步驟進行。（3）心肌超微結構觀察。隨機抽取各組左心室缺血區心肌組織，做成切片，供心肌超微結構觀察，每組1只。取各組大鼠左心室心肌組織，切成1 mm3大小，超微標本入3％戊二醛固定液固定2 h，1％鋨酸固定1 h，逐級酒精、丙酮脫水后，環氧樹脂包埋，超薄切片，經鈾、鉛雙重染色后，送中山大學第一附屬醫院電鏡室，1200E X透射電鏡觀測各組大鼠心肌超微結構變化。

1.6 統計學處理 應用SPSS15.0統計軟件。計量資料以±s）表示，采用t檢驗、χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組心肌線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比較 見表1。結果示各治療組血清TNF-α、IL-6的表達較模型組均明顯降低，而模型組與正常組，加味參附顆粒高劑量組與加味參附顆粒低劑量組、曲美他嗪組相比差異均有統計學意義（均P＜0.05）。模型組中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均較低，而曲美他嗪組、加味參附顆粒低劑量組及加味參附顆粒高劑量組較模型組明顯升高（P＜0.05）；加味參附顆粒高劑量組與曲美他嗪組相近（P＞0.05）。

表1 各組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比較（分，±s）

表1 各組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性比較（分，±s）

與模型組比較，*P＜0.05；與正常對照組相比，△P＜0.05；與加味參附顆粒高劑量組比較，▲P＜0.05。

組 別 n Na+-K+-ATP酶 Ca2+-ATP酶 TNF-α（ng/L） IL-6（ng/L）正常組 10 3.15±0.75* 1.76±0.39* 53.96±3.18* 352.40±87.20*模型組 10 2.23±0.48 0.66±0.63 420.36±67.57△3704.44±1048.81△曲美他嗪組 10 3.35±0.58* 1.13±0.56*105.86±4.03* 672.92±143.94*加味參附顆粒低劑量組 10 3.01±0.53*▲ 0.96±0.50*▲180.48±44.84*▲1783.60±130.04*▲加味參附顆粒高劑量組 10 3.30±0.63 1.12±0.498 108.64±0.50* 996.52±40.65*

2.2 各組心肌透射電鏡觀察結構情況 正常組：肌原纖維縱向走向，肌節結構明顯，肌絲排列整齊，明暗帶結構清楚，其間可見線粒體及肌漿網，線粒體排列較整齊，結構清楚，線粒體間可見少量脂滴，細胞核核膜清楚，可見核孔，無聚集成塊、無空泡形成等現象。模型組：心肌肌原纖維排列較紊亂，肌節結構模糊，明暗帶結構不清，心肌收縮帶形成，線粒體增生，體積增大，壓迫肌原纖維，線粒體形狀大小不一，排列尚整齊，結構不清，部分溶解、斷裂、核膜部分溶解、消失，邊緣不規則，部分線粒體空泡形成等。曲美他嗪組：心肌肌原纖維排列較整齊，肌節結構較明顯，明暗帶較清楚，線粒體大多排列較整齊，結構較清楚，包膜完成，未見明顯腫脹，未見溶解與斷裂，線粒體間可見少量脂滴，細胞核核膜部分不清楚。加味參附顆粒組高、低劑量組：肌原纖維排列整齊，肌節結構明顯，肌絲排列整齊，明暗帶清楚，其間可見線粒體及肌漿網，線粒體排列較整齊，結構清楚，嵴結構清晰，未見腫脹，線粒體間可見少量脂滴，細胞核核膜較清楚，包膜完整，無結塊及邊集現象，無空泡形成，兩圖比較差異性不大。

3 討論

Na+-K+-ATP酶（鈉泵）和Ca2+-ATP酶是廣泛存在于組織細胞及細胞器膜上的一種蛋白酶，可調節細胞內外Na+-K+梯度［1］，心室肌、心房肌和蒲肯耶纖維的這種跨膜梯度是形成動作電位去極相Na+內流和K+外流的動力，是形成細胞內鈣穩態的基礎。心肌細胞內Ca2+濃度是心肌維持正常生理功能的重要因素，心肌細胞Na+-K+-ATP酶受到抑制時，必然導致細胞內Na+升高，K+降低，Na+-Ca2+交換減少造成細胞內Ca2+增高，進而影響心肌的收縮力。Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活力的高低是細胞能量代謝及功能有無損傷的重要指標。

圖1 心肌透射電鏡圖（×18500）

炎癥細胞因子級聯反應對于心衰的發生發展具有重要作用，可降低心肌收縮力及心輸出量，促進自發性功能障礙、胰島素抵抗、內皮損失及血液高凝狀態等［2］。血清IL-6、TNF-α的水平與心血管危險因素患者病情嚴重程度密切相關［3］，可能通過下調肌漿網Ca2+-ATP酶，推遲舒張心肌細胞鈣離子的再吸收和衰減，導致心臟舒張功能不全［4］。

本實驗中，模型組Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均較低，而曲美他嗪組、加味參附顆粒低劑量組及加味參附顆粒高劑量組較模型組明顯升高，加味參附顆粒與模型組差異顯著，說明益氣溫陽、活血利水的加味參附顆粒治療效果明顯。實驗進一步表明加味參附顆粒并降低血清中細胞因子TNF-α、IL-6的表達，說明益氣溫陽、活血通絡中藥復方制劑有效成分配伍對上述細胞因子的產生和表達有一定的抑制作用，且療效優于單一用藥組，與曲美他嗪功效相近。

同時本研究發現，經加味參附顆粒干預后的心衰大鼠的心肌纖維、線粒體等組織受到的破壞明顯減少，肌原纖維排列整齊，肌節結構明顯，肌絲排列整齊，明暗帶清楚，其間可見線粒體及肌漿網，線粒體排列較整齊，結構清楚，嵴結構清晰，未見腫脹，線粒體間可見少量脂滴，細胞核核膜較清楚，包膜完整，無結塊及邊集現象，無空泡形成，說明加味參附顆粒在改善心肌超微結構方面優勢亦較明顯。

既往的研究也表明，加味參附顆粒不僅改善慢性心衰患者的臨床癥狀，降低體循環外周阻力，減輕左心后負荷，增強心肌收縮力、提高心輸出量有明顯的功效，而且通過6 min步行實驗的辦法評價出改善患者心功能，改善預后，提高生活質量等方面亦療效明顯［5-7］。

本實驗選擇以心肌線粒體Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性為觀察指標，通過電鏡觀察加味參附顆粒對心衰大鼠心肌超微結構的影響，結果提示模型大鼠的Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明顯下降，存在能量代謝異常，而經加味參附顆粒干預的心衰大鼠Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性未見下降，并有一定程度的升高，提示加味參附顆粒可能通過提高心衰大鼠的心肌ATP酶來改善心衰大鼠的心肌能量代謝，進而對心肌的超微結構產生影響，這可能是加味參附顆粒治療心衰的作用機制。故從陽虛血瘀水停-心肌超微結構角度探討加味參附顆粒對心衰治療的干預效應，開發中藥有效成分配伍組成的新藥，有望成為心衰治療學研究的重要途徑。

［1］Xie ZJ，Cail T.Na+-K+-ATP ase-Mediated Signal Transduction：from protein interaction to cellular function［J］.Mol Interv，2003，3（3）：157-168.

［2］Parish RC，Evans JD.Inflammation in chronic heart failure. Ann Pharmacother.2008 Jul，42（7）：1002-1016，273-286. Epub 2011 Jan 19.

［3］Meyer T，Stanske B，Kochen MM，et al.Elevated serum levels of interleukin-10 and tumor necrosis factor-α are both associated with vital exhaustion in patients with cardiovascular risk factors［J］.Psychosomatics，2010 May，51（3）：248-56. Erratum in：Psychosomatics，2011，52（1）：97-98.

［4］Wu CK，Lee JK，Chiang FT，et al.Plasma levels of tumor necrosis factor-α and interleukin-6 are associated with diastolic heart failure through down regulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase［J］.Crit Care Med，2011，May，39（5）：984-992.

［5］袁丁，靳利利，李典鴻，等.加味參附顆粒治療慢性心力衰竭療效分析［J］.吉林中醫藥，2011，31（7）：633-634.

［6］蘇慧，靳利利，李典鴻，等.加味參附顆粒改善慢性心力衰竭患者生存質量的臨床研究［J］.福建中醫藥，2011，42（5）：27-29.

［7］黃培紅，靳利利，劉秋江，等.加味參附顆粒對慢性心力衰竭患者預后的影響［J］.福建中醫藥，2011，42（5）：19-20.

Ef fect of Jiaweishenfu Granule on Ultrastructure of M yocardium in Rats with Chronic Heart Failure

JIN Li-li，YUAN Ding，SHI Zhen-yu，et al. The Second TCM Hospital of Guangdong Province，Guangdong，Guangzhou 510095，China

Objective：To establish heart failure model of rats with chronic heart failure by abdominal aorta constriction and to observe the effect of Jiaweishenfu granule on myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme，activity of Ca2+-ATP enzyme，serum TNF-α and IL-6 expression，and ultrastructure.M ethods：50 male SD rats were randomly divided into normal control group，model group，Qumei trimetazidine group，low dose of Jiaweishenfu granule group，and high dose of Jiaweishenfu granule group，10 rats in each group.Rats with heart failure model were established by abdominal aortic coarctation method.Myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme，Ca2+-ATP enzyme activity，and expressions of serum TNF-α and IL-6 were determined.Ultrastructure under electron microscopic was observed.Results：low dose of Jiaweishenfu granule group can significantly improve activity of myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-ATP enzyme，and reduce myocardial ultrastructure damage.Conclusion：Jiaweishenfu granule has a protective effect on ultrastructure of heart failure rats.It works by inhibiting expression of chronic heart failure cytokines，and by regulating activity of myocardial mitochondria Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-ATP enzyme.

Heart failure；Jiaweishenfu granule；Ultrastructure

R285.5

A

1004-745X（2014）04-0602-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.04.016

廣東省科技計劃課題（2010B030700021）

2013-12-19）