利用幾種植物提取物對NDMA阻斷效果的研究

王瑞，馬儷珍，田瑞，方長發

（1.天津農學院農業分析測試中心，天津300384；2.天津農學院食品科學與生物工程學院，天津300384）

N-亞硝胺是N-亞硝基化合物的一種，其合成的前體物包括蛋白質的分解產物——胺類物質和亞硝基化劑（如硝酸鹽、亞硝酸鹽及氣態氮氧化物等）。N-亞硝胺是目前國際上公認的一種強致癌物[1]。大量的實驗證明某些食品中存在一定量的N-亞硝胺，如腌臘制品、煙熏制品及發酵食品等。其中有的是食品中天然存在N-亞硝基化合物的前體物，在食品加工過程中轉化成N-亞硝胺和其它N-亞硝基化合物；有的是生產過程需要添加的添加劑，人體可經消化道、呼吸道等途徑接觸這些致癌物，亞硝胺類是引起人類癌癥的主要物質[2-4]。因此，阻斷或減少N-亞硝胺的生成是預防腫瘤發生的一個重要措施。

目前VC作為一種公認的有效的阻斷劑，常用作N-亞硝胺阻斷實驗的陽性對照，以此比較某種待研究物質或某種天然食品的阻斷效果。近年來，國內外學者利用含有黃酮化合物、VC等抗氧化成份等天然植物來抑制亞硝胺的合成，阻斷效果明顯[5-10]。

酚類化合物是一族結構中含有酚的化合物，廣泛存在于植物食品中，由于其羥基取代的高反應性和吞噬自由基的能力而有很好的抗氧化活性[11]。植物多糖是天然大分子物質，是由許多相同或不同的單糖以α-或β-糖苷鍵所組成的化合物，大量藥理及臨床研究證實，多糖有調節免疫、抗癌、抗肥胖、控制血糖、降膽固醇、降血脂、清除自由基、抗衰老功能等生理功能[12]。目前國內外針對亞硝胺在體外模擬胃液的酸性條件下，利用多糖多酚等植物提取物對亞硝胺抑制作用的研究報道較少。

由于揮發性N－亞硝胺在食品中以10 μg/kg水平存在，要求分析方法具有足夠的靈敏度和特異性。近年來，由于NPD（氮磷檢測器）的技術發展，其對含磷、氮化合物均有極高的靈敏度及選擇性，使用壽命更長，穩定性、重復性更好，且背景基流由以前的10－9A降到10－13A，最小檢測限大大降低，操作方便易控制，檢測時間大為縮短。人們開始采用氣相色譜儀（GC）配備氮磷檢測器（NPD）來測定煙草中特有亞硝胺[13]，并取得了一些進展，但該技術應用于食品中亞硝胺的測定尚未見報道。由于該儀器技術普適性強，食品行業內的許多實驗室都已配備，無需價格昂貴的專用檢測設備，準確度高，重復性好，所以應用前景十分廣闊。

本試驗在確定亞硝胺GC-NPD檢測條件的基礎上，利用不同濃度枸杞多糖、原花青素（葡多酚）、八角提取物等天然植物提取物在體外模擬胃液環境，進行阻斷NDMA合成的研究，通過測定添加這些提取物前后的NDMA生成量的變化，來探討所選物質對NDMA的阻斷作用。

1 材料與方法

1.1 試劑

濃鹽酸、氯化鈉、氨基磺酸銨、二氯甲烷、濃硫酸，以上試劑均為分析純：購自天津傲然精細化工研究所。二甲胺鹽酸鹽為化學純：購自上海天蓮精細化工有限公司；亞硝酸鈉為分析純：購自天津市北方天醫化學試劑廠；N-亞硝基二甲胺標準品色譜純：邁瑞爾公司提供。

1.2 材料

枸杞多糖（提取溶劑：乙醇、水；含量：50.66%）、原花青素（提取溶劑：乙醇、水；含量：99.90%）：購自天津市尖峰天然產物研究開發有限公司；八角精油：天津頂興食品有限公司；抗壞血酸（分析純）：天津市化學試劑三廠。

1.3 儀器與設備

日本島津GC-17A氣相色譜儀，配有NPD（氮磷檢測器）檢測器及Clarity色譜數據工作站；色譜柱DBWAX：內徑0.25 mm，長為30 m；WE-2水浴恒溫振蕩器：天津歐諾儀器儀表有限公司；BS224S電子天平：塞多利斯科學儀器北京有限公司。

1.4 方法

1.4.1 亞硝胺檢測方法

本試驗采用配備NPD檢測器的氣相色譜儀，對亞硝胺進行測定。

色譜條件：采用毛細管氣相色譜法[14-15]，條件如下：進樣口溫度：180℃；檢測器溫度：220℃；NPD檢測器電流為40PA。色譜柱溫度：程序升溫，初溫50℃保持4 min，8℃/min升至120℃保持1 min，再以8℃/min升至180℃保持1 min。色譜柱DB-WAX：內徑0.25 mm，長30 m的毛細管柱；載氣：氮氣；進樣量0.6 μL。

1.4.2 定性與定量的方法

利用保留時間定性，峰面積定量。

1.4.3 標準曲線的配制

將N-亞硝基二甲胺標準品定容至配制成濃度約為100 μg/mL的標準品。用此作為母液分別吸取1、2、4、6、8 稀釋成濃度為 10、20、40、60、80 μg/mL 的標準工作液。

1.4.4 單因素試驗添加量的選擇

VC等的添加劑在食品中的添加量一般在0.01%～0.05%。因此，本試驗中分別取多糖、多酚提取物溶劑的 0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL 即添加量在 0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.1%進行抑制效果的實驗。

1.4.5 阻斷試驗

參照Narmada等的方法[16]，取10 mL的模擬胃液（2 g氯化鈉，7 mL濃鹽酸，定容至1 000 mL）加入反應試管，再加入一定量的植物提取物溶液，加入1mol/L的亞硝酸鈉溶液1 mL，0.5 mol/L的二甲胺溶液2 mL，充分混合后用模擬胃液定容至20 mL。在將反應試管放入37℃水浴中加熱一小時，其中每隔15 min振搖一次，取出后加入3 mL 100 mmol/L氨基磺酸銨溶液和1 mL硫酸溶液（1∶3）終止其反應，加入10 mL二氯甲烷，用分液漏斗萃取N-亞硝基二甲胺（振搖1 min，靜置30 min），收集二氯甲烷定容至10 mL。然后用氣相色譜測定其中NDMA的含量，并根據以下公式計算阻斷率。

式中：A0為空白反應中NDMA的峰面積；Ax為加入抑制劑后NDMA的峰面積。

2 結果與分析

2.1 標準曲線

試驗中分別配制濃度為 10、20、40、60、80、100 μg/mL的標準工作液，依次進樣得出標準曲線，如圖1，N-亞硝基二甲胺標準曲線。

圖1 N-亞硝基二甲胺標準曲線Fig.1 N-nitroso-dimethylamine standard curve

20 μg/mL標準工作液的色譜圖如圖2，標準工作液色譜圖。

圖2 20 μg/mL標準工作液色譜圖Fig.2 20 μg/mL standard working solution chromatogram

從標準曲線看出，對N-亞硝基二甲胺（NDEA）含量進行測定，在濃度 10 μg/mL～100 μg/mL 范圍內有良好線性（R2=0.991 9）。

2.2 回收率試驗

取100 μg/mL的NDMA標準溶液1 mL添加到模擬胃液中，按照樣品處理的過程進行恒溫水浴、萃取等步驟后，同樣定容到10 mL，并用GC檢測，峰面積記為A1；同時做兩次平行峰面積分別記為A2、A3。10 μg/mL標準溶液的峰面積記為A0（3次平均值）。

表1 回收率試驗Table 1 Recovery test

2.3 精密度試驗及檢出限

對空白樣品進行5次平行測定，其結果如表2，相對標準偏差RSD=0.036 7。

根據3倍信噪比得出該方法檢出限為0.1 μg/mL。

表2 精密度試驗峰值表Table 2 Precision test peak table

通過以上試驗，GC-NPD法檢測亞硝胺可得到較穩定精確的數據，濃度在 10 μg/mL～100 μg/mL 范圍內有良好線性（R2=0.991 9），平均回收率79.68%，RSD=3.67%。該方法檢出限為0.1 μg/mL。

2.4 枸杞提取物對亞硝胺的抑制

試驗中分別取枸杞多糖溶液 0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL即添加量分別為0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.1%進行抑制效果的實驗。枸杞多糖與VC對NDMA的抑制作用如圖3。

圖3 枸杞多糖與VC對NDMA的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of Lycium barbarum polysaccharides and VCto NDMA

枸杞多糖最高抑制率色譜比較圖如圖4。結果表明，枸杞多糖的最高抑制率在添加量在0.05%時出現，為65.78%，在低于此劑量時抑制率隨著枸杞多糖溶液加入量的增大而升高，但高于此水平時，抑制效果則表現出相反的變化趨勢。而對照VC在添加量為0.05%時，抑制率也達到了64.42%，且在濃度為0.1%時它的抑制率為65.40%。

圖4 枸杞多糖最高抑制率色譜比較圖Fig.4 Lycium barbarum polysaccharides the maximum inhibition rate chromatographic comparison chart

枸杞多糖具有還原性，其阻斷亞硝胺生成的機理是，首先與亞硝酸鈉作用，使得反應物底物中的亞硝酸鈉濃度降低，二甲胺反應程度降低，達到阻止亞硝胺生成的目的。

2.5 原花青素對亞硝胺的抑制

試驗中分別取原花青素溶液 0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL即添加量分別為0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.1%進行抑制效果的實驗。原花青素與VC對NDMA的抑制作用如圖5。

圖5 原花青素對NDMA的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of procyanidins on NDMA

圖5結果表明，在原花青素加入量小于0.04%時，抑制NDMA生成的效果，當加入0.04%原花青素溶液時，其抑制效果僅有3.28%。當加入0.05%原花青素溶液時，抑制效果達到27.04%。在添加量在0.1%時，抑制率僅為30.24%，是VC抑制率的50%。

當往原花青素中依次加入亞硝酸鈉與二甲胺時，原花青素優先同亞硝酸鈉作用，使得二甲胺不能與亞硝酸鈉反應，達到阻止亞硝胺生成的目的。

2.6 八角精油對亞硝胺的抑制

實驗中分別取八角精油 0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL進行抑制效果的實驗。八角精油對NDMA的抑制作用如圖6。

圖6 八角精油對NDMA的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of star anise oil on NDMA

從圖6可見，在加入0.4 mL八角精油時，抑制效果就已經達到89.45%，當劑量增加到0.6 mL八角精油時，抑制率已上升到90%以上，在隨后的實驗組中逐步加大八角精油的劑量，發現八角精油對NDMA生成反應的抑制效率也隨之增高，在加入2.0 mL八角精油的反應體系中所得到的抑制率最高達到98.17%。

八角精油中成分比較復雜八角精油中含茴香醚、黃樟醚、茴香醛、茴香酮、水芹烯等。具有較好的抑菌、具有抗氧化性、殺蟲活性和抗自由基氧化作用，可作為食品天然防腐劑和保鮮劑[15]。

3 討論

1）以往的一些關于亞硝胺阻斷的研究中，對于亞硝胺的檢測使用的大多是利用分光光度法，對于氣相色譜用于亞硝胺的抑制實驗只有張健斌等[15]有報道，而配備氮磷檢測器的氣相色譜法（GC-NPD）在亞硝胺抑制中的應用報道更少。相對于分光光度法，GC-NPD對于樣品顏色的干擾更小，提高了實驗的準確度及穩定性。

2）枸杞的抑制率最大值在55%左右，這可能與枸杞多糖的純度（50.66%）有關，而且其中存在其它成分，可能對亞硝胺的阻斷作用有影響。枸杞多糖的純品對亞硝胺的阻斷作用還有待于進一步研究。

3）實驗證明八角精油的抑制效果最明顯，在添加量為2.0 mL時，最高抑制率在98%左右。本實驗中體外抑制亞硝胺的方法模擬胃液代替超純水，使反應體系的pH值相對穩定，八角精油較大的添加量（2 mL）也可能是高抑制率（98%）的原因，其它物質均是配制成一定的濃度，這可能是影響最終的抑制率較大的因素，還有待于研究。

4）在本試驗中，枸杞多糖、原花青素及VC的抑制效果較低。分析其原因，可能是亞硝酸鹽添加的濃度過高（添加量3.45 g/kg，國標為0.15 g/kg），使得低濃度的抑制劑產生“抑制疲勞”，不能完全發揮抑制作用。

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