中心組合設計法優化超聲波提取蘆薈甙工藝

謝貞建，顏軍，魏俊，薛劍，王衛，*

（1.成都大學生物產業學院，四川成都610106；2.肉類加工四川省重點實驗室，四川成都610106）

蘆薈（Aloe）屬多年生百合科多肉質草本植物，可藥食兩用[1]。新鮮蘆薈不易儲藏，暴露在空氣中的蘆薈凝膠易被氧化而失去功效[2]。蘆薈的主要活性成分蘆薈甙（Aloin）為多羥基蒽醌類衍生物，具有抗炎、抗輻射等功效，兼有抗氧化、抗腫瘤、調節血糖等[3-4]，其對心血管系統、免疫系統、胃損傷、肝臟等也都具有良好的保護作用，能有效地促進傷口愈合[5]，在食品[6]、醫藥[7]、化妝品[8]等領域具有廣闊的應用前景和開發價值。

目前，常用的中草藥活性成分的提取方法大多采用常溫浸泡、索氏抽提、加熱回流等，但這些方法提取時間長、耗費試劑量大，在實際應用中存在很大的局限性。超聲波輔助提取利用超聲波產生的空化效應、機械效應、熱效應和其他次級效應能在不改變有效成分結構的基礎上，縮短提取時間，提高提取率，在中草藥活性成分的提取上得到廣泛的應用[9-11]。本實驗運用超聲波輔助提取蘆薈干粉中蘆薈甙，并選用中心組合旋轉設計試驗和響應曲面法分析試驗結果，建立蘆薈甙提取的數學模型，找出最佳試驗條件，在此試驗條件下預測得率，并確定自變量最佳值[12-13]。為蘆薈甙工業化生產提供技術參數，為蘆薈資源的綜合利用及副產品的有益增值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

材料：云南庫拉索蘆薈（市售）；蘆薈甙標準品（≥98%，中國生物制品檢定所）；甲醇（HPLC級）；甲醇（AR）；無水乙醇（AR）；冰醋酸（AR）。

儀器：島津LC-20AB型HPLC：島津；T15RT型臺式高速離心機：上海天美生化儀器設備工程有限公司；KQ3200型超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司；BSA124S型電子分析天平：北京賽多利斯天平有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品的處理

稱取蘆薈干粉1 g（精確到0.000 1 g），按相應料液比加入乙醇溶液，混勻，超聲30 min后冷卻定容，10 000 r/min離心20 min，取上清液以0.45 μm濾膜過濾，待用。

1.2.2 蘆薈甙含量測定

色譜條件：色譜柱 Inertsil ODS C18（5 μm，4.6×150 mm）；流速：1 mL/min；流動相：甲醇-0.1%醋酸水=40：60；柱溫：40 ℃；波長：359 nm；進樣量 10 μL。

以峰面積（Y）與蘆薈甙含量（X）外標法定量，回歸方程Y=12 742.69X-3013.684，相關系數R2=0.9999。

1.2.3 提取時間的影響

準確稱取過80目篩的蘆薈干粉1.000 0 g，用75%乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，在30°C下，分別提取 10、20、30、40 min，按樣品處理方法處理，用“1.2.2蘆薈甙含量測定”方法測定。

1.2.4 提取溫度的影響

準確稱取過80目篩的蘆薈干粉1.000 0 g，用75%乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，分別在30、40、50、60、70 ℃下超聲提取 30 min，按樣品處理方法處理，用“1.2.2蘆薈甙含量測定”方法測定。

1.2.5 乙醇濃度的影響

準確稱取過80目篩的蘆薈干粉1.000 0 g，分別用20%、40%、60%、80%、100%的乙醇溶液15 mL溶解于25 mL容量瓶中，在40℃下超聲提取30 min。按樣品處理方法處理，用“1.2.2蘆薈甙含量測定”方法測定。

1.2.6 液料比的影響

準確稱取過80目篩的蘆薈干粉1.000 0 g，分別用80%的乙醇溶液 10、15、20、25、30、40 mL 溶解于50 mL容量瓶中，在40℃下超聲提取30 min。按樣品處理方法處理，用“1.2.2蘆薈甙含量測定”方法測定。

1.2.7 Central Composite試驗設計

在單因素基礎上，選擇乙醇濃度、液料比和提取溫度為研究對象，并以蘆薈甙含量作為響應值設計Central Composite試驗。試驗因素水平及編碼見表1。試驗輔助軟件為Design Expert（version 8.0 Stat-Ease Inc.，Minneapolis，MN.USA）。

表1 Central Composite設計試驗因素水平及編碼Table 1 Factor level and coding of Central Composite design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 提取時間對蘆薈甙含量提取的影響

按1.2.3方法考察提取時間的影響，結果見圖1。由圖1可知，在提取時間低于30 min時，蘆薈甙含量隨著提取時間的增加而增加，而大于30 min，蘆薈甙含量趨于平衡，無明顯變化，說明在此條件下，超聲30min蘆薈甙提取液已達到飽和，不會隨時間的增加而增大，在后續試驗中，選擇提取30 min。

2.1.2 提取溫度對蘆薈甙含量提取的影響

按1.2.4方法考察提取溫度的影響，結果見圖2。

圖1 提取時間對蘆薈甙含量的影響Fig.1 Effect of extracted time on the yield of aloin

圖2 提取溫度對蘆薈甙含量的影響Fig.2 Effect of extracted temperature on the yield of aloin

由圖2可知，溫度達到40℃時，蘆薈甙含量有一個較大值。而隨著溫度的升高，達到60℃以上，蘆薈甙含量迅速下降，原因可能是溫度過高使得乙醇揮發。溫度在40℃～60℃范圍，都比較適合蘆薈甙的提取。

2.1.3 乙醇濃度對蘆薈甙含量提取的影響

按1.2.5方法考察乙醇濃度對蘆薈甙含量提取的影響，結果見圖3。

圖3 乙醇濃度對蘆薈甙含量的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of aloin

由圖3可知，乙醇的最佳提取濃度在80%左右，乙醇濃度太低，則溶劑的極性較小，不利于蘆薈甙的溶出；而乙醇濃度太高，則溶劑中水分含量較少，不利于植物纖維的溶脹，反而降低了乙醇與蘆薈的反應，從而使得蘆薈甙含量降低。

2.1.4 液料比對蘆薈甙含量提取的影響

按1.2.5方法考察液料比對蘆薈甙含量提取的影響，結果見圖4。

圖4 液料比對蘆薈甙含量的影響Fig.4 Effect of ethanol volume on the yield of aloin

由圖4可知最佳液料比為15∶1（mL/g）。當液料比小于 15∶1（mL/g），蘆薈干粉浸潤不完全，蘆薈甙提取不完全；當大于 15∶1（mL/g）時，蘆薈甙含量變化不明顯，還有略微下降的趨勢，基于經濟的考慮，同時較高的液料比會增加濃縮的工作量，所以選取15∶1（mL/g）。

2.2 響應面試驗設計及結果

在單因素試驗基礎上選取乙醇濃度、液料比和提取溫度3個因素做中心組合設計，以蘆薈甙含量為響應值，共20個試驗點，其中14個為析因點，6個為中心點。設計方案及結果見表2。

表2 中心組合設計方案及結果Table 2 Program and results of Central Composite design

利用design－expert軟件對上述結果進行多元回歸擬合，得到蘆薈甙含量Y對乙醇濃度（A）、液料比（B）和提取溫度（C）的二次多項回歸方程分別為：Y=2.99－0.14A+0.048B+0.028C+0.036AB－0.019AC+0.046BC-0.17A2+5.89×10－4B2+0.015C2+0.031A2B+0.21A2B2。

2.3 模型的顯著性檢驗

對模型進行回歸方差分析及顯著性檢驗，結果見表3，回歸模型系數顯著性檢驗結果見表4。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

表4 回歸模型顯著性檢驗Table 4 Significance test for each term of developed regression model

由表 3 可知，模型的 F=25.22，P＜0.000 1＜0.01，說明所選用的模型具有高度的顯著性。失擬項F=0.76，在 P＜0.05 上不顯著（P=0.563 2＞0.05）。R2越接近 1，說明此模型越能預測其響應值[14]。模型的R2為0.971 8，表明模型擬合程度良好，預測值與實際值之間有較好的相關性。模型的校正系數RAdj2為0.933 4，表明該模型能解釋93.34%的響應值的變化。模型響應值的信噪比為24.489，表明有很強的信號。

由表4可知，模型的一次項A、二次項A2極顯著，交互項BC顯著，二次交互項A2B2極顯著，其余因素不顯著，表明各種影響因素對于蘆薈甙提取的影響不是簡單的線性關系，其中因素A（乙醇濃度）對蘆薈甙含量的提取具有很重要的作用。

圖5為蘆薈甙含量（Y）實測值相對回歸方程預測值的偏離情況對照圖。在設定的20次試驗中，最小響應值為2.28 mg/g，最大響應值為3.33 mg/g。在本次試驗中，預測值與實測值之間的最大偏差為：最大偏差/%=即最大偏差為2.05%。從這一方面說明采用響應曲面法進行蘆薈甙的提取的試驗設計所得的回歸模型是可行的。

圖5 實測值與模型預測值對照圖Fig.5 Plot of model-predicted values against experimental values of the extraction yield of aloin

2.4 響應面交互作用分析

通過模型方程所作的等高線圖見圖6～圖8。等高線的形狀反映出交互效應的強弱大小，圓形表示因素交互作用不顯著，而橢圓形或馬鞍形則表示兩因素交互作用顯著[15]。圖6顯示了其等高線呈馬鞍形，當溫度為45℃時，液料比和乙醇濃度的交互效應顯著。在低乙醇濃度條件下，隨著液料比的增加，其蘆薈甙含量先降低后增高；而在高乙醇濃度下，蘆薈甙的含量隨液料比增加不明顯，所以對于蘆薈甙的提取，乙醇濃度不需要太高。由圖7知，乙醇濃度與提取時間交互效應較顯著，在較低的乙醇濃度下，需較高溫度才能得到一個高的蘆薈甙含量。由圖8知，提取溫度與液料比交互效應顯著，在高液料比條件下，隨著溫度的增加，蘆薈甙含量都是呈一個上升的趨勢；在低液料比條件下，隨溫度的增加蘆薈甙含量由高到低。而在液料比20∶1（mL/g），溫度45℃可得到一較大值。

2.5 驗證實驗

利用軟件對回歸模型進行分析，選取蘆薈甙含量為最大值，得最優化條件液料比 20∶1（mL/g），提取溫度45℃，乙醇濃度70%下提取30 min進行驗證實驗。其預測值為蘆薈甙含量為3.33 mg/g，在優化得到的最優條件下進行試驗，平行兩次結果為3.33 mg/g，3.29 mg/g，平均含量為3.31 mg/g，與預測值3.33 mg/g相差不顯著，響應面法優化蘆薈甙的提取工藝是切實可行的。

圖6 溫度為45℃時乙醇濃度與液料比對蘆薈甙含量影響的等高線圖Fig.6 Contour plot of the effect of concentration of ethanol and liquid-solid ratio on Alion content at temperature level of 45℃

圖7 液料比為15∶1(mL/g）時乙醇濃度與溫度對蘆薈甙含量影響的等高線圖Fig.7 Contour plot of the effect of concentration of ethanol and temperature on Alion content at liquid-solid ratio level of 15∶1（mL/g）

圖8 乙醇濃度為80%時液料比與溫度對蘆薈甙含量影響的等高線圖Fig.8 Contour plot of the effect of liquid-solid ratio and temperature on Alion content at concentration of ethanol level of 80%

3 結論

1）本實驗得出蘆薈干粉中蘆薈甙的最佳提取條件為：液料比 20∶1（mL/g），提取溫度 45 °C，乙醇濃度 70%下提取30 min。此條件下蘆薈甙含量達到3.31 mg/g，經驗證試驗證明該工藝切實可行。

2）采用非線性數學模型擬合，復相關系數平方達到0.971 8，模型擬合程度良好，預測值與實際值之間有較好的相關性，在本次試驗中，預測值與實測值之間的最大偏差為2.05%。

3）通過回歸模型顯著性檢驗和依據模型方程所作的等高線可以看出，乙醇濃度的一次項和二次項都非常顯著，是影響蘆薈甙提取的一個重要的因素，對于蘆薈甙的提取，乙醇濃度不需要太高。液料比和提取溫度交互效應較顯著，各種影響因素對于蘆薈甙提取的影響不是簡單的線性關系。

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