以食品級原料進行植物乳桿菌發酵及其抗真菌活性的研究

王海寬，陳 沖，王應東，沈發迪

(工業發酵微生物教育部重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457)

乳酸菌用于食品和飼料中有著悠久的歷史，其可以通過降低食品 pH和產生有機酸、蛋白質類活性物質、羥基脂肪酸和酚類化合物等抑菌物質，抑制腐敗菌和病原微生物的生長[1]．研究發現，部分乳酸菌具有抑制真菌生長的功能．植物乳桿菌屬于乳酸菌，據報道，也有類似抑菌功能．袁晶[2]用雙層平板拮抗法測定植物乳桿菌 ZJ316對煙曲霉有明顯的抑制作用．Crowley等[3]將植物乳桿菌作為發酵劑應用到酸奶和橙汁中，發現植物乳桿菌可延遲腐敗真菌黏質酵母(R. mucilaginosa)的生長．Gerez 等[4]從 95 株乳酸菌中篩選出 4株具有抑制青霉菌屬、鐮孢菌屬、曲霉菌屬(霉菌來源于被污染的面包)的乳酸菌，分別為植物乳桿菌 CRL778、羅伊式乳桿菌 CRL1100、短乳桿菌 CRL772和 CRL796，并將酵母與篩選出的乳酸菌混合加入面團進行發酵，使生產出的面包保質期延長了3,d．Yang等[5]將植物乳桿菌AF1的上清液濃縮4倍后噴到黃豆表面，與對照相比，可使黃豆表面的黃曲霉延緩7,d萌發．

以食品級原料為培養基經乳酸菌發酵后抗菌活性高的發酵液進行凍干濃縮等處理作為抗真菌防腐劑直接加入食品中，由于菌株及原料皆為安全的，因此產生的物質也可直接食用．這不僅滿足了消費者對食品防腐劑的安全性要求，同時節省了新型防腐劑投入使用前進行的安全性實驗．此外，由于原料單一、后續操作簡單等原因使得其有利于大規模工業化生產．植物乳桿菌作為出發菌株用于酸奶和酸豆奶中已有研究[6–7]，本實驗以脫脂奶粉及大豆蛋白為發酵培養基，篩選出1株對婁地青霉具有明顯抑制作用的植物乳桿菌，并對其產生的抑菌物質特性進行了初步探索．

1 材料與方法

1.1 菌種

60株植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)均來自內蒙古農業大學“乳品生物技術與工程”教育部重點實驗室；婁地青霉菌(Penicillium roqueforti)購于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏編號為 CGMCC 3.07903．

1.2 培養基

乳酸菌活化培養基采用 MRS培養基：蛋白胨10,g，牛肉膏 10,g，酵母膏 5,g，KH2PO42,g，檸檬酸三銨 2,g，乙酸鈉 2,g，葡萄糖 20,g，吐溫 80 1,mL，MgSO4·7H2O 0.5,g，MnSO4·4H2O 0.25,g，蒸餾水 1,L，pH 6.5、115,℃滅菌 20,min．

大豆蛋白培養基：20,g/L大豆蛋白，20,g/L葡萄糖，115,℃滅菌 15,min．

脫脂奶粉培養基：100,g/L脫脂奶粉，115,℃滅菌15,min．

真菌培養基采用 PDA培養基：取馬鈴薯 200,g洗凈去皮切塊，加蒸餾水 1,L煮沸約 30,min，用紗布過濾，定容至 1,L，再加葡萄糖 20,g和瓊脂 8,g充分溶解后，121,℃滅菌 20,min．

1.3 植物乳桿菌的活化培養和發酵液、孢子懸液的制備

1.3.1 菌株活化

取少量保存于30%甘油內的活菌于MRS瓊脂平板上劃線，挑取單菌落用 MRS固體斜面培養基進行菌種活化傳代，從活化的 MRS固體斜面培養基上挑取適量菌體接入MRS液體培養基中，37,℃靜置培養20,h．

1.3.2 植物乳桿菌發酵液的制備

從活化的種子液中按 5%接種量接種于發酵培養基內，37,℃恒溫培養48,h后即得到乳酸菌發酵液．1.3.3 孢子懸液的制備

將接種婁地青霉的PDA斜面培養1周，用無菌水洗下孢子，3層擦鏡紙過濾除去菌絲得到孢子懸液．用血球記數板進行計數，確定孢子懸液的濃度．

1.4 抑菌活性檢測方法

1.4.1 雙層平板點接法[8]

按 2%接種量將活化后的菌株接種于 MRS液體培養基中，在厭氧箱中 37,℃液體培養 48,h后，吸取5,μL點在MRS固體平板中央，37,℃再培養48,h后，在平板上倒10,mL的PDA培養基(含有婁地青霉菌的孢子 106,mL–1)，28,℃培養 48,h，測量抑菌圈半徑，每個樣品 3個平行．該方法用于菌株的篩選和植物乳桿菌 IMAU10014抗真菌物質生成的發酵特性優化中抑菌活性的測定．

1.4.2 瓊脂平板擴散法[9]

在滅菌的平板中倒 1層 10,mL的 PDA培養基(含有婁地青霉菌的孢子 106,mL–1)，待其凝固后在表面放入無菌的牛津杯(d＝7.64,mm)，將濃縮后的乳酸菌發酵上清液 100,μL接入牛津杯中，28,℃培養48,h，測量抑菌圈半徑，每個樣品 3個平行．該方法用于植物乳桿菌發酵濃縮上清液抑菌活性的檢測．

1.5 抗真菌活性物質的基本性質

1.5.1 發酵濃縮上清液的制備

從活化的種子液中按 5%接種量接種于大豆蛋白培養基內，37,℃恒溫培養 48,h后，4,℃、10,000,r/min離心 15,min去除菌體，將上清液用 0.45,μm 無菌濾膜過濾后，–70,℃預凍 4,h后，冷凍干燥機冷凍36,h，懸浮在水中，濃縮到原始濃度的20倍，4,℃冰箱保存備用．用瓊脂平板擴散法測定其抑婁地青霉活性．1.5.2 pH對抗真菌活性物質的影響

將原始的濃縮上清液用氫氧化鈉溶液分別調至pH 4.0、5.0、6.0、7.0，每個處理 3 個平行，盡量降低因調解 pH而引起的活性物質濃度的變化，考察環境酸堿度對抗菌物抑菌活性的影響．

1.5.3 酶處理對抗真菌活性物質的影響

用氫氧化鈉溶液將濃縮上清液調節 pH至 7.0，分別用胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K處理，使之在37,℃水浴條件下反應2,h，然后在100,℃水浴加熱10,min使蛋白酶變性．以不加酶處理的濃縮液作為對照，每個處理 3個平行，用瓊脂平板擴散法測定經過酶處理的樣品和對照的抑菌活性．

1.5.4 溫度對抗真菌活性物質的影響

將500,μL濃縮上清液放入1.5,mL的離心管內，分別在不同溫度下加熱1,h及121,℃加熱20,min，每個處理3個平行，將經過以上處理的樣品和未經處理的樣品分別用瓊脂平板擴散法測抑菌活性．

由圖1可知：當pH＜6.5時，乳酸菌發酵液的抑菌活性隨著pH升高而遞增；當pH達到6.5時，抑菌活性最高，其抑菌圈半徑為15.2,mm．

2.2.2 培養溫度對發酵液抑菌活性的影響

其他條件不變，在不同溫度下培養 48,h后測定發酵液的抑菌活性，結果如圖 2所示．乳酸菌發酵液的抑菌活性隨著溫度升高而遞增，溫度達到 37,℃左右抑菌活性最高，抑菌圈半徑為15.3,mm．

圖2 溫度對抑菌活性的影響Fig.2 Influence of temperature on the antifungal activity

2 結果與討論

2.1 菌種篩選

從60株植物乳桿菌中篩選出對婁地青霉抑菌圈半徑＞14,mm 的 8株乳酸菌：IMAU80107、IMAU 80091、IMAU80163、IMAU80105、IMAU80158、IMAU80161、IMAU80104、IMAU10014．將其在脫脂奶粉培養基和大豆蛋白培養基中進行復篩．

當乳酸菌的培養基由MRS培養基改為脫脂奶粉培養基后，其抑菌圈均在 14,mm 以下．當培養基由MRS培養基改為大豆蛋白培養基時乳酸菌的抑菌活性也有所降低，僅有植物乳桿菌IMAU10014的抑菌圈半徑在14,mm以上，因此選取植物乳桿菌 IMAU 10014且培養基為大豆蛋白培養基進行后續實驗．

2.2 植物乳桿菌 IMAU10014抗真菌物質生成的發酵特性優化

為提高植物乳桿菌 IMAU10014的抑菌活性，分別選取了可能影響其抑菌效果的 pH、溫度、葡萄糖含量及大豆蛋白含量 4個因素進行單因素實驗和正交優化實驗．該實驗中菌種發酵液的抑菌活性通過

1.4.1 節雙層平板點接法測定．

2.2.1 培養基初始pH對發酵液抑菌活性的影響

保持其他條件不變，調節培養基初始 pH，分別培養48,h后測定發酵液的抑菌活性，初始pH對抑菌活性的影響如圖1所示．

圖1 培養基初始pH對抑菌活性的影響Fig.1 Influence of initial pH on the antifungal activity

2.2.3 葡萄糖質量濃度對發酵液抑菌活性的影響

保持其他條件不變，培養 48,h后測定發酵液的抑菌活性，比較培養基中不同葡萄糖質量濃度對抑菌活性的影響，結果如圖 3所示．乳酸菌發酵液的抑菌活性在葡萄糖質量濃度為 20,g/L時達到最高，繼續增加葡萄糖的質量濃度會抑制其抑菌活性．

圖3 葡萄糖質量濃度對抑菌活性的影響Fig.3 Influence of glucose concentration on the antifungal activity

2.2.4 大豆蛋白質量濃度對發酵液抑菌活性的影響

保持其他條件不變，培養 48,h后測定發酵液的抑菌活性，比較不同大豆蛋白質量濃度對抑菌活性的影響，結果見表 1．培養基中大豆蛋白質量濃度從10,g/L增加至 50,g/L，乳酸菌發酵液的抑菌活性無明顯差異，大豆蛋白質量濃度在 20,g/L時其抑菌活性比其他質量濃度時的略高．

表1 大豆蛋白質量濃度對抑菌活性的影響Tab.1 Influence of soyabean protein concentration on the antifungal activity

2.2.5 正交實驗確定最佳培養基成分及培養條件

為進一步提高植物乳桿菌 IMAU10014發酵豆乳培養基的抑菌活性，在上述單因素實驗的基礎上，選擇各因素的3個最佳水平設計正交實驗，結果見表2. 由表2可知：4個因素的F比均小于F臨界值，因此 4個因素對其影響均不顯著．由極差分析可得對植物乳桿菌 IMAU10014抑菌效果影響主次順序是：溫度＞葡萄糖質量濃度＞大豆蛋白質量濃度＞pH，理論最佳組合為溫度 37,℃、pH 6.5、葡萄糖 20,g/L、大豆蛋白5,g/L，此時抑菌效果最佳．

表2 大豆蛋白培養基及發酵條件正交實驗結果Tab.2 Results of soy protein medium and fermentation condition orthogonal experiment

在此優化條件下進行驗證實驗，雙層平板法檢測其對婁地青霉的抑菌活性，最終抑菌圈半徑為16.5,mm，抑菌效果與在MRS中的結果十分相近，相比于優化前的抑菌圈半徑有顯著提高．

2.3 抗真菌活性物質的基本性質

為進一步研究植物乳桿菌 IMAU10014產生抑菌物質的性質，IMAU10014發酵大豆蛋白培養基后，分別檢測了不同 pH、溫度及酶處理后濃縮上清液的抑菌活性．

2.3.1 pH對抗真菌活性物質的影響

pH對抗真菌活性物質抑菌活性的影響如圖4所示．由圖 4可知，未經處理的空白組其 pH在 3.5左右，濃縮上清液的抑菌活性隨著pH的升高逐漸降低，當 pH為 7.0時最低，但仍有抑菌活性．這說明植物乳桿菌 IMAU10014發酵大豆蛋白培養基產生的抑菌物質除了酸類還有其他物質．這一點與李紅娟等[10]報道的 pH對干酪乳桿菌產生的抗真菌物質的影響一致．

圖4 pH對抑菌活性的影響Fig.4 Influence of pH value on the antifungal activity

2.3.2 酶處理對抗真菌活性物質的影響

酶處理對抗真菌活性物質抑菌活性的影響如圖5所示．由圖 5可以看出，中性蛋白酶處理后抑菌活性基本不變，而用蛋白酶 K和胰蛋白酶處理后活性有所降低．這說明此抑菌物質對中性蛋白酶不敏感，對蛋白酶K和胰蛋白酶敏感．因此，可初步斷定植物乳桿菌 IMAU10014發酵大豆蛋白培養基產生的抗真菌活性物質中含有蛋白類物質．

圖5 酶處理對抑菌活性的影響Fig.5 Influence of enzyme on the antifungal activity

有關產蛋白類抗真菌物質的乳酸菌的報道不多，報道的乳酸菌有以下幾種：乳酸乳球菌乳酸亞種(Lc.lactis subsp.lactis)[11]、干酪乳桿菌假植物亞種(Lb.casei subsp.pseudoplantarum)[12]、小球片球菌(P. pentosaceous)[13]、副干酪乳桿菌(L. paracasei)[14]等．關于植物乳桿菌的也有報道，Str?m 等[15]發現植物乳桿菌MiLAB393能產生抗真菌的環二肽．

2.3.3 溫度對抗真菌活性物質的影響

溫度對抗真菌活性物質抑菌活性的影響見表 3．由表3可知，植物乳桿菌IMAU10014發酵后的濃縮上清液分別于 60,℃加熱 1,h、80,℃加熱 1,h、100,℃加熱 1,h、121,℃加熱 20,min，抑菌圈大小基本不變.這說明發酵液中的抑菌物質有很好的熱穩定性．

表3 溫度對抑菌活性的影響Tab.3 Influence of temperature on the antifungal activity

3 結 語

本實驗以MRS為培養基從60株植物乳桿菌中篩出8株抑菌活性較好的菌株，又以大豆蛋白和脫脂奶粉為培養基從 8株植物乳桿菌中進一步篩選出 1株具有較強抑菌活性的菌株 IMAU10014，并確定了其發酵培養基為大豆蛋白．對植物乳桿菌 IMAU10014的發酵培養基成分及培養條件進行優化，得到最佳培養基組合及培養條件：葡萄糖 20,g/L、大豆蛋白5,g/L、pH 6.5、溫度 37,℃植物乳桿菌 IMAU10014發酵 48,h時抑菌效果最佳．分別檢測了不同 pH、溫度及酶處理對 IMAU10014發酵濃縮上清液的抑菌活性的影響，結果表明：濃縮上清液在 pH 3.5～7.0范圍內均有抑菌活性，且隨著 pH的升高抑菌活性逐漸降低．抑菌物質對溫度不敏感．經過胰蛋白酶和蛋白酶K處理后抑菌活性有所降低．

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